UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA, BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DE BACTERIAS PATOGÉNICAS EN EL CULTIVO DE TOMATE (Solanum lycopersicum L.) Y SU SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS. Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales con énfasis en Protección de Cultivos DARÍO ARNALDO ALVARADO RODRÍGUEZ Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2025 ii DEDICATORIA A mis padres Arnaldo y Verónica, a mi hermana Roxana, y a mi pareja Ana. iii AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue posible gracias al financiado de la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica bajo el proyecto C0466 “Uso de antibióticos en Costa Rica para el control de infecciones bacteriales en el cultivo de tomate: Aplicación, eficacia y alternativas en pruebas in vitro y de campo”, el Sistema de Estudios de Posgrado (SEP), Programa de Posgrado en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales (PPCARN), Centro de Investigación en Protección de Cultivos (CIPROC) y el Laboratorio de Técnicas Moleculares del CIPROC. Quiero agradecer a mis padres y a mi hermana por su apoyo incondicional en todas las etapas de mi vida. A mi pareja Ana por acompañarme y motivarme siempre a dar lo mejor de mí en todo lo que hago. A mi directora de tesis Dra. Mónica Blanco Meneses por confiar en mí, por su acompañamiento y mentoría en todo este camino. A los miembros de mi comité asesor, Dr. Fernando García Santamaría y Dr. Walter Barrantes Santamaría por su apoyo y consejos en la realización de este trabajo. A las personas del Laboratorio de Técnicas Moleculares del CIPROC por abrirme las puertas y hacerme uno más del laboratorio, Anny Calderón, Alejandro Sebiani, Jacqueline Camacho y Gabriel Vargas, gracias por todo su apoyo en el proceso y por su amistad. A las personas del Laboratorio de Fitopatología del CIPROC, en especial a Gabriela Chinchilla por todo su apoyo, consejos y motivación, a Mauricio Serrano, Oscar Castro, José Esquivel y Pedro Montenegro, gracias por las pláticas, el cafecito de la tarde y por todo el apoyo que me brindaron. Al Dr. Carlos Chacón y Yeimy Ramírez del Laboratorio de Bacteriología Médica de la Facultad de Microbiología por brindarme su apoyo y asesoramiento en parte del desarrollo experimental. A todos los amigos que hice en el camino y que me acompañaron en esta etapa, maestros y compañeros de los que aprendí mucho, Edgar Vargas, Isanna Victoriano, María José Cordero, Luis Fernando Benavides, Elizabeth González y su familia, Fabián Cruz, Humberto Lezama, Manuel Solís, Danny Humphreys, Isaac Arias, Andrés Araya, Carolina Quirós. A Karla Segura, Kattya Granados y Priscilla Castillo por su gran apoyo en todos los procesos administrativos. A la familia Boza Oviedo, por su hospitalidad y cariño, en especial a mami Maru Oviedo Q.E.P.D. iv v ÍNDICE DE CONTENIDO DEDICATORIA ................................................................................................. ii AGRADECIMIENTOS ..................................................................................... iii HOJA DE APROBACIÓN………………………………………………………….. iv RESUMEN ...................................................................................................... vii ABSTRACT ....................................................................................................viii ÍNDICE DE CUADROS .................................................................................... ix ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................... xi ÍNDICE DE ANEXOS ......................................................................................xiv INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1 BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 4 OBJETIVOS ..................................................................................................... 8 OBJETIVO GENERAL ................................................................................... 8 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 8 CAPÍTULO 1: Caracterización morfológica, bioquímica y molecular de bacterias aisladas de plantas de tomate con infecciones bacterianas colectadas en el Valle Central de Costa Rica ............................................... 9 1.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................ 9 1.2 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................. 12 1.2.1 Material vegetal y aislamientos bacterianos ............................... 12 1.2.2 Descripciones morfológicas ....................................................... 16 1.2.3 Pruebas fisiológicas y bioquímicas ............................................ 17 1.2.4 Análisis molecular ...................................................................... 22 1.3 RESULTADOS ................................................................................. 27 1.3.1 Caracterización morfológica de los aislamientos ....................... 27 1.3.2 Caracterización fisiológica y bioquímica de los aislamientos ..... 28 1.3.3 Análisis molecular ...................................................................... 33 1.4 DISCUSIÓN ...................................................................................... 49 1.5 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................. 55 1.6 ANEXOS........................................................................................... 67 CAPÍTULO 2: Bacterias causantes de necrosis medular y decoloración de tejido en plantas de tomate en el Valle Central de Costa Rica .................. 73 2.1 INTRODUCCIÓN .............................................................................. 73 2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................. 76 vi 2.2.1 Aislamientos bacterianos y material vegetal .............................. 76 2.2.2 Inoculación y evaluación ............................................................ 78 2.2.3 Análisis estadístico .................................................................... 78 2.2.4 Análisis de secuencias multilocus (MLSA) de cepas patogénicas 80 2.3 RESULTADOS ................................................................................. 83 2.3.1 Pruebas de patogenicidad ......................................................... 83 2.3.2 Análisis de secuencias multilocus (MLSA) de cepas patogénicas 93 2.4 DISCUSIÓN ...................................................................................... 96 2.5 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................... 101 2.6 ANEXOS......................................................................................... 108 CAPÍTULO 3: Evaluación in vitro de la sensibilidad de bacterias patogénicas y no patogénicas de tomate a cinco antibióticos de uso agrícola empleados con frecuencia en Costa Rica ...................................111 3.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................ 111 3.2 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................... 114 3.2.1 Aislamientos bacterianos y antibióticos de uso agrícola .......... 114 3.2.2 Prueba de difusión en disco (método Kirby-Bauer) .................. 114 3.2.3 Prueba de dilución en agar para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) ......................................................................... 116 3.3 RESULTADOS ............................................................................... 119 DISCUSIÓN............................................................................................... 133 3.4 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................... 139 DISCUSIÓN GENERAL.................................................................................144 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 147 CONCLUSIONES ..........................................................................................152 RECOMENDACIONES ..................................................................................154 vii RESUMEN El tomate (Solanum lycopersicum L.) es una de las hortalizas más cultivadas a nivel mundial. En Costa Rica, su producción se ve favorecida durante todo el año debido a las condiciones ambientales. Sin embargo, la producción también se ve afectada por el desarrollo de enfermedades de origen biótico, como las causadas por bacterias fitopatógenas. La identificación precisa de las bacterias patogénicas presentes en el cultivo, así como su caracterización y la determinación de la efectividad de los métodos utilizados para su manejo son herramientas necesarias para el desarrollo de estrategias de control efectivas. En este estudio se realizó la caracterización morfológica y bioquímica de bacterias aisladas de plantas de tomate con síntomas de infecciones bacterianas provenientes de diferentes localidades del Valle Central de Costa Rica. Se realizaron pruebas de diagnóstico con cebadores específicos mediante la amplificación de ADN a partir de muestras de tejido, en las que se detectó la presencia de los géneros Pseudomonas y Xanthomonas, y las especies P. mediterranea, P. syringae pv. tomato y Pectobacterium carotovorum pv. carotovorum. Se analizó la comunidad bacteriana por medio de la secuenciación parcial del gen 16S ARNr a partir de aislamientos puros y se determinó que 55.74% de los aislamientos eran de la clase Gammaproteobacteria con Pseudomonas como el género dominante. También se determinó la patogenicidad y virulencia de las cepas de Pseudomonas alliivorans LTM 13.1.2, P. flavescens LTM 14.2.2, P. capsici LTM 78.3.2, reportadas por primera vez en Costa Rica como agentes causales de la necrosis medular del tomate e identificadas mediante MLSA, además de las cepas de P. straminea LTM 78.2.1 y Cedecea neteri LTM 72.2.1 identificadas como causantes de la decoloración del tejido vascular. Se evaluó la sensibilidad de cepas patogénicas y no patogénicas a cinco antibióticos de uso agrícola y se determinó que 23% de los aislamientos evaluados crecieron en presencia de estreptomicina y la misma proporción creció en presencia de tetraciclina, 85% creció en presencia de kasugamicina y 100% en presencia de validamicina. El crecimiento de todos los aislamientos fue inhibido en presencia de gentamicina. De los aislamientos patogénicos, uno creció en presencia de estreptomicina y dos en presencia de kasugamicina. Además, se registró que 85% de los aislamientos presentó crecimiento en presencia de múltiples antibióticos. Este estudio presenta resultados de interés para todos los involucrados en la cadena de producción de tomate en Costa Rica, con una base de conocimiento sobre la estructura de la comunidad bacteriana, la identificación de bacterias fitopatógenas que atacan el cultivo, además de la identificación de cepas resistentes a los antimicrobianos comúnmente utilizados en el país. viii ABSTRACT Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the most widely cultivated vegetables worldwide. In Costa Rica, its production benefits from favorable environmental conditions throughout the year. However, this production is also affected by the development of biotic diseases, such as those caused by phytopathogenic bacteria. Accurate identification of the pathogenic bacteria present in the crop, along with their characterization and the assessment of the effectiveness of management methods, are essential tools for developing effective control strategies. In this study, the morphological and biochemical characterization of bacteria isolated from tomato plants showing symptoms of bacterial infections from different localities in the Central Valley of Costa Rica was performed. Diagnostic tests were conducted using specific primers through DNA amplification from tissue samples, which revealed the presence of the genera Pseudomonas and Xanthomonas, as well as the species P. mediterranea, P. syringae pv. tomato, and Pectobacterium carotovorum pv. carotovorum. The bacterial community was analyzed through partial sequencing of the 16S rRNA gene from pure isolates, identifying that 55.74% of the isolates belonged to the class Gammaproteobacteria, with Pseudomonas as the dominant genus. Pathogenicity and virulence of Pseudomonas alliivorans LTM 13.1.2, P. flavescens LTM 14.2.2, and P. capsici LTM 78.3.2 strains were also determined, which were reported for the first time in Costa Rica as causal agents of tomato pith necrosis and were identified using MLSA. Additionally, strains of P. straminea LTM 78.2.1 and Cedecea neteri LTM 72.2.1 were identified as the causal agents of vascular tissue discoloration. The sensitivity of pathogenic and non-pathogenic strains to five agricultural antibiotics was evaluated. It was determined that 23% of the isolates grew in the presence of streptomycin and the same proportion exhibited growth in the presence of tetracycline, 85% of the isolates grew in the presence of kasugamycin, and 100% grew in the presence of validamycin. The growth of all isolates was inhibited in the presence of gentamicin. Among the pathogenic isolates, one grew in the presence of streptomycin, and two in the presence of kasugamycin. Moreover, 85% of the isolates exhibited growth in the presence of multiple antibiotics. This study provides valuable insights for all stakeholders involved in the tomato production chain in Costa Rica, offering a knowledge base on bacterial community structure, the identification of phytopathogenic bacteria affecting the crop, and the identification of strains resistant to commonly used antimicrobials in the country. ix ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1.1 Procedencia y síntomas de infecciones bacterianas observados en plantas de tomate colectadas en el Valle Central de Costa Rica..................... 13 Cuadro 1.2 Cebadores específicos utilizados para detectar la presencia de bacterias patógenas en tejido de plantas de tomate con síntomas de infecciones bacterianas colectadas en fincas del Valle Central de Costa Rica. ................. 25 Cuadro 1.3 Caracterización morfológica, fisiológica y bioquímica de las colonias de 146 aislamientos bacterianos aislados a partir de muestras de plantas de tomate con síntomas de infecciones bacterianas colectadas en siete cantones del Valle Central de Costa Rica. ..................................................................... 30 Cuadro 1.4 Detección de géneros o especies de bacterias fitopatógenas objetivo mediante amplificación de ADN con cebadores específicos a partir de muestras de tejido de plantas de tomate con síntomas de infecciones bacterianas. ...... 34 Cuadro 1.5 Características morfológicas de las colonias de 61 aislamientos bacterianos agrupados en 23 géneros identificados mediante la secuenciación parcial del gen 16S ARNr................................................................................ 44 Cuadro 1.6 Características fisiológicas y bioquímicas de las colonias de 61 aislamientos bacterianos evaluadas mediante pruebas bioquímicas convencionales, agrupados en 23 géneros identificados mediante la secuenciación parcial del gen 16S ARNr. ....................................................... 46 Cuadro 2.1 Cepas evaluadas en las pruebas de patogenicidad. .................... 77 Cuadro 2.2 Cebadores utilizados para la amplificación y secuenciación parcial de los genes 16S ARNr, gyrB, rpoD y rpoB para el análisis de secuencias multilocus (MLSA) de las cepas patogénicas de Pseudomonas spp. .............. 81 Cuadro 2.3 Extensión de necrosis medular/decoloración de tejido (cm) en plantas de tomate de las variedades “Acorazado” y “JR” inoculadas con cepas bacterianas procedentes de varias localidades del Valle Central de Costa Rica a los 21 días después de inoculación (ddi) bajo condiciones de invernadero. .... 86 Cuadro 2.4 Efecto de la extensión de la lesión interna (cm) sobre el crecimiento de las plantas (cm) (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 − 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴) en las variedades de tomate “Acorazado” y “JR” a los 21 días después de inoculación (ddi) bajo condiciones de invernadero. ............................................................................................... 92 x Cuadro 3.1 Comportamiento de cepas bacterianas en presencia de cuatro antibióticos de uso agrícola evaluada mediante pruebas de difusión en disco y determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) mediante dilución en agar. ..............................................................................................................121 Cuadro 3.2 Parámetros de modelos de regresión logística para la probabilidad de crecimiento de bacterias patogénicas y no patogénicas de tomate ante los antibióticos de uso agrícola evaluados...........................................................127 xi ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1 Agrupamiento de las cepas bacterianas según el perfil bioquímico combinado de pruebas convencionales y el sistema VITEK® 2. ...................... 32 Figura 1.2 Mapa de distribución y frecuencia de las bacterias fitopatógenas detectadas en muestras de tejido de plantas de tomate sintomáticas mediante la amplificación de ADN con cebadores específicos. .......................................... 37 Figura 1.3 Diversidad taxonómica y abundancia relativa porcentual de las cepas bacterianas aisladas de tejido sintomático de plantas de tomate en fincas del Valle Central de Costa Rica. ........................................................................... 39 Figura 1.4 Diversidad taxonómica y abundancia relativa porcentual de las cepas bacterianas en los diferentes tejidos de las plantas de tomate evaluadas: raíz, base del tallo, tallo inferior, tallo superior, hoja, y fruto. ................................... 40 Figura 1.5 Diversidad taxonómica y abundancia relativa porcentual de las cepas bacterianas aisladas de tejido sintomático de plantas de tomate en siete cantones del Valle Central de Costa Rica. ...................................................... 41 Figura 1.6 Árbol filogenético consenso de cepas aisladas de tejido sintomático de plantas de tomate y cepas tipo de referencia descargadas de la base de datos del GenBank del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), elaborado a partir de las secuencias parciales del gen 16S ARNr mediante un análisis filogenético Bayesiano. ...................................................................... 42 Figura 1.7 Características morfológicas y bioquímicas de los aislamientos correspondientes a los 23 géneros identificados mediante la secuenciación parcial del gen 16S ARNr................................................................................ 48 Figura 2.1 Crecimiento (cm) de las plantas de tomate de las variedades “JR” y “Acorazado” inoculadas con cepas bacterianas y plantas testigo inoculadas con buffer fosfato salino (PBS) a los 21 días después de inoculación (ddi) bajo condiciones de invernadero. ........................................................................... 84 Figura 2.2 Extensión (cm) de la necrosis medular o la decoloración del tejido en plantas de tomate de las variedades “Acorazado” y “JR” inoculadas con cepas bacterianas y plantas testigo inoculadas con buffer fosfato salino (PBS) a los 21 días después de inoculación (ddi) bajo condiciones de invernadero. .............. 88 Figura 2.3 Necrosis medular en plantas de tomate inoculadas con cepas bacterianas, evaluada 21 días después de la inoculación (ddi). ...................... 89 xii Figura 2.4 Decoloración de tejido vascular en plantas de tomate inoculadas con cepas bacterianas, evaluada 21 días después de la inoculación (ddi). ........... 90 Figura 2.5 Síntomas externos observados en plantas de tomate inoculadas con cepas bacterianas, evaluados 21 días después de la inoculación (ddi) bajo condiciones de invernadero. ........................................................................... 91 Figura 2.6 Efecto de la extensión de la necrosis medular (cm) sobre el crecimiento de la planta (cm) en plantas de tomate de las variedades “JR” y “Acorazado” 21 días después de la inoculación (ddi) bajo condiciones de invernadero. .................................................................................................... 92 Figura 2.7 Árbol filogenético consenso de cepas de Pseudomonas spp. elaborado a partir de las secuencias parciales concatenadas de los genes 16S ARNr, gyrB, rpoD y rpoB. ................................................................................ 93 Figura 2.8 Árbol filogenético consenso elaborado a partir de las secuencias parciales del gen 16S ARNr de la cepa LTM 72.2.1 que causó decoloración del tejido, y de las cepas no patogénicas. ............................................................ 95 Figura 3.1 Zonas de inhibición de crecimiento de las cepas bacterianas ante cuatro agentes antibióticos evaluada con el método de difusión en disco. .....122 Figura 3.2 Prueba de difusión en disco (método Kirby-Bauer) con cinco antibióticos de uso agrícola. ...........................................................................123 Figura 3.3 Concentración mínima inhibitoria (CMI) de cuatro agentes antibióticos evaluada con el método de dilución en agar. ............................125 Figura 3.4 Prueba de dilución en agar para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los antibióticos de uso agrícola tetraciclina, estreptomicina, gentamicina, kasugamicina y validamicina. ....................................................126 Figura 3.5 Probabilidad de crecimiento (%) de las bacterias evaluadas ante cuatro antibióticos de uso agrícola, con base en las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) determinadas mediante el método de dilución en agar.......128 Figura 3.6 Porcentaje de aislamientos (%) con capacidad de crecimiento en presencia de antibióticos de uso agrícola utilizados en Costa Rica para el control de infecciones bacterianas en las plantas. .....................................................129 Figura 3.7 Porcentaje de aislamientos patogénicos y no patogénicos con capacidad de crecimiento en presencia de uno o múltiples antibióticos. ........130 xiii Figura 3.8 Porcentaje de aislamientos según su nivel de virulencia, agrupados de acuerdo con su capacidad de crecimiento en presencia de uno o múltiples antibióticos.. ...................................................................................................131 Figura 3.9 Agrupamiento de los aislamientos bacterianos con base en las características de patogenicidad, virulencia y la combinación de los valores de CMI y los diámetros de zonas de inhibición.. .................................................132 xiv ÍNDICE DE ANEXOS Cuadro S1.1 Cepas de referencia utilizadas en el análisis filogenético para la identificación de los aislamientos bacterianos. Se utilizaron las secuencias parciales del gen 16S ARNr de cepas tipo depositadas en la base de datos del GenBank del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI). ..... 67 Cuadro S1.2 Resultados de pruebas fisiológicas y bioquímicas convencionales y lectura de las tarjetas GN del sistema VITEK® 2 para 17 cepas bacterianas evaluadas. Las cepas están agrupadas por su similitud de acuerdo con el análisis de agrupamiento aglomerativo jerárquico. ......................................... 71 Cuadro S2.1 Cepas de referencia utilizadas en el análisis de secuencias multilocus (MLSA). Se utilizaron las secuencias parciales de los genes 16S ARNr, gyrB, rpoD y rpoB de cepas tipo descargadas de la base de datos de GenBank del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI). ....108 Cuadro S2.2 Cepas de referencia utilizadas en el análisis filogenético para la identificación de la cepa LTM 72.2.1 y las cepas no patogénicas. Se utilizaron las secuencias parciales del gen 16S ARNr de cepas tipo descargadas en la base de datos del GenBank del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI). ...................................................................................110 1 INTRODUCCIÓN El tomate (Solanum lycopersicum L.) pertenece a la familia Solanaceae, donde también se encuentran la papa (S. tuberosum L.), la berenjena (S. melongena L.), los chiles, ajíes y pimientos (Capsicum spp.), entre otros (Heuvelink, 2018). Es una planta dicotiledónea, herbácea, y perenne cultivada de forma anual para el consumo de sus frutos, ya sean frescos o procesados (Escanola et al., 2009; Heuvelink, 2018; López-Marín, 2017). Es de desarrollo rápido, ciclo vegetativo corto, con un periodo de crecimiento de 90 a 150 días (Escanola et al., 2009; FAO, 2022); puede crecer de forma rastrera, erecta o semierecta (Cestoni et al., 2006), y existen variedades de crecimiento determinado, indeterminado o semideterminado (Blancard, 2013; Cestoni et al., 2006; López-Marín, 2017). Es una de las hortalizas más cultivadas a nivel mundial, con una producción anual de más de 192.3 millones de toneladas en el año 2023 y un área sembrada de más de 5.4 millones de hectáreas (FAOSTAT, 2024). Las principales áreas de producción están ubicadas en zonas templadas que se caracterizan por tener largos períodos de verano y precipitaciones invernales; sin embargo, los tomates también se producen en climas subtropicales (Heuvelink, 2018), y crecen en todas las latitudes bajo diferentes condiciones climáticas y de producción, aunque las condiciones óptimas para su desarrollo son temperaturas diurnas de 18-25°C, temperaturas nocturnas de 15-20°C y humedades relativas de 55-75% (Blancard, 2013; Escanola et al., 2009). El país con mayor producción a nivel mundial es China con casi 70 millones de toneladas en el año 2023, equivalente al 35.46% de la producción mundial, seguido por India con 20.4 millones de toneladas (10.33%), Turquía con 13.3 millones de toneladas (6.73%) y Estados Unidos con 12.3 millones de toneladas (6.26%) (FAOSTAT, 2024). En Costa Rica, el tomate es una de las hortalizas que más se produce y se consume, la demanda del producto hace que sea un cultivo muy intensivo, y las condiciones ambientales favorecen la producción durante todo el año (López- Marín, 2021). Su cultivo se realiza principalmente en la región del Valle Central, siendo las zonas con mayor producción la zona Central Occidental, seguida de 2 la zona Central Oriental, y en menores cantidades las zonas Central Sur, Brunca, Chorotega, Pacífico Central y Huetar Norte (López-Marín, 2017), con una producción de 55,307 toneladas métricas sembradas en 1,510 hectáreas en el año 2018 (INEC, 2019). El tomate es un cultivo que puede ser afectado por factores de estrés abiótico, incluida la degradación ambiental, el cambio climático y la contaminación química, y de igual forma puede ser atacado por plagas y por organismos fitopatógenos como hongos, virus, y bacterias, que, en conjunto, disminuyen su rendimiento notablemente (Blancard, 2013; Sundström et al., 2014), causando síntomas que resultan de la interacción de los mecanismos de ataque del patógeno y los mecanismos de defensa de la planta, así como de los efectos fisiológicos causados por la enfermedad (Arauz-Cavallini, 2011). Las bacterias son microorganismos capaces de causar enfermedades en un amplio rango de plantas hospederas, y pueden colonizar tanto la superficie como los tejidos internos, provocando diferentes síntomas como manchas, pecas, cancros, pudrición de tejidos, y desequilibrios hormonales, entre otros (Kannan et al., 2016; Strange & Scott, 2005). Esta variedad de síntomas afecta el rendimiento en la producción de los cultivos causando pérdidas económicas significativas (Kannan et al., 2016; Mansfield et al., 2012). Debido a esto, las bacterias representan una amenaza mundial para la producción agrícola, por lo que su control es crucial para la seguridad alimentaria (Strange & Scott, 2005; Sundström et al., 2014). Las enfermedades de origen bacteriano en las plantas son más frecuentes en regiones tropicales y subtropicales, donde las condiciones cálidas y húmedas son ideales para su crecimiento, por ende, la severidad puede ser mayor (Kannan et al., 2016; Sundström et al., 2014), especialmente en época lluviosa, ya que provoca una mayor incidencia de enfermedades (Brenes-Peralta et al., 2016; Saborío, 2019). La mayoría de las especies de bacterias fitopatógenas se encuentran dentro de las familias Lysobacteraceae (= Xanthomonadaceae) del orden Lysobacterales (= Xanthomonadales), Pseudomonadaceae del orden Pseudomonadales, Burkholderiaceae del orden Burkholderiales, Microbacteriaceae del orden 3 Micrococcales, Enterobacteriaceae, Erwiniaceae (anteriormente Enterobacteriaceae) y Pectobacteriaceae (anteriormente Enterobacteriaceae) del orden Enterobacterales (Adeolu et al., 2016; Kannan et al., 2016; Tindall, 2014). Una gran variedad de bacterias se ha asociado al cultivo de tomate, tanto patógenas como saprófitas. Se han identificado en conjunto más de 250 especies, biovares y patovares de los cuales, siete géneros pueden causar enfermedades en la planta: Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas, Clavibacter, Pectobacterium (anteriormente Erwinia) y Dickeya (anteriormente Pectobacterium) (Blancard, 2013; Kannan et al., 2016; Samson et al., 2005), además de algunas especies del género Agrobacterium que atacan las raíces de la planta (Blancard, 2013). Algunas de las especies patogénicas pueden provocar síntomas similares, por lo que la identificación y el diagnóstico preciso de las bacterias causales de las enfermedades en los cultivos son aspectos cruciales para el desarrollo de métodos de control adecuados (Ramírez-Rojas et al., 2016). Los esfuerzos para el control de las enfermedades de origen bacteriano se basan principalmente en estrategias preventivas orientadas a reducir las fuentes de inóculo y la dispersión del patógeno (Kolomiiets et al., 2019; Sundin et al., 2016). Las aplicaciones de compuestos de cobre o de compuestos de antibióticos han sido parte de las herramientas con las que cuentan los productores para el combate de las infecciones bacterianas en las plantas (Lamichhane et al., 2018; Sundin et al., 2016). En Costa Rica se han utilizado varios productos antibióticos en el cultivo de tomate, principalmente a base de compuestos de oxitetraciclina, estreptomicina, gentamicina y kasugamicina (Blanco-Meneses et al., 2023), aunque no existen productos autorizados para este cultivo según el Servicio Fitosanitario del Estado (SFE, 2024). El desarrollo de resistencia a los antibióticos debido al uso inadecuado de estos compuestos representa un problema de salud a nivel mundial (McManus et al., 2002; McManus & Stockwell, 2000), y existe la preocupación de la influencia del uso de antibióticos en agricultura sobre la resistencia de bacterias presentes en animales y especialmente las relacionadas a la salud humana, mediada por la 4 transferencia horizontal de genes (Maeusli et al., 2020; McManus et al., 2002; McManus & Stockwell, 2000; Stockwell & Duffy, 2012). Esto denota la importancia de realizar una evaluación de las bacterias presentes en los cultivos por medio de una identificación con un enfoque integrado, así como la determinación de la sensibilidad de estas bacterias a los antibióticos comúnmente utilizados en el país. BIBLIOGRAFÍA Adeolu, M., Alnajar, S., Naushad, S., & S. Gupta, R. (2016). Genome-based phylogeny and taxonomy of the ‘Enterobacteriales’: proposal for Enterobacterales ord. nov. divided into the families Enterobacteriaceae, Erwiniaceae fam. nov., Pectobacteriaceae fam. nov., Yersiniaceae fam. nov., Hafniaceae fam. nov., Morganellaceae fam. nov., and Budviciaceae fam. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 66(12), 5575–5599. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.001485 Arauz-Cavallini, L. F. (2011). Fitopatología, un enfoque agroecológico (2a ed.). Editorial UCR. Blancard, D. (2013). Tomato diseases: identification, biology and control (2a ed.). CRC press. Blanco-Meneses, M., Castro-Zúñiga, O., & Calderón-Abarca, A. (2023). Diagnóstico del uso de antibióticos en regiones productoras de tomate en Costa Rica. Agronomía Costarricense, 47(1), 87–99. https://doi.org/10.15517/rac.v47i1.53967 Brenes-Peralta, L., Jimenez-Morales, M. F., & Gamboa-Murillo, M. (2016). 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The family name Solimonadaceae Losey et al. 2013 is illegitimate, proposals to create the names ‘Sinobacter soli’ comb. nov. and ‘Sinobacter variicoloris’ contravene the Code, the family name Xanthomonadaceae Saddler and Bradbury 2005 and the order name Xanthomonadales Saddler and Bradbury 2005 are illegitimate and notes on the application of the family names Solibacteraceae Zhou et al. 2008, Nevskiaceae Henrici and Johnson 1935 (Approved Lists 1980) and Lysobacteraceae Christensen and Cook 1978 (Approved Lists 1980) and order name Lysobacteriales Christensen and Cook 1978 (Approved Lists 1980) with respect to the classification of the corresponding type genera Solibacter Zhou et al. 2008, Nevskia Famintzin 1892 (Approved Lists 1980) and Lysobacter Christensen and Cook 1978 (Approved Lists 1980) and importance of accurately expressing the link between a taxonomic name, its authors and the corresponding description/circumscription/emendation. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 64, 293–297. https://doi.org/10.1099/ijs.0.057158-0 8 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Realizar la caracterización morfológica, bioquímica, molecular y patogénica de las bacterias asociadas a enfermedades en cultivos de tomate del Valle Central del país, así como su sensibilidad a los antibióticos de uso agrícola. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Identificar las bacterias patógenas presentes en cultivos de tomate mediante técnicas morfológicas, bioquímicas y moleculares, y referenciarlas geográficamente en las zonas productoras evaluadas. • Establecer relaciones de patogenicidad entre las bacterias identificadas sobre plantas sanas de tomate por medio de los postulados de Koch. • Determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias identificadas a los antibióticos de uso agrícola en el cultivo de tomate. 9 CAPÍTULO 1: Caracterización morfológica, bioquímica y molecular de bacterias aisladas de plantas de tomate con infecciones bacterianas colectadas en el Valle Central de Costa Rica 1.1 INTRODUCCIÓN Las plantas albergan una compleja comunidad microbiana que juega un papel importante en procesos de desarrollo y en la salud de la planta; algunos organismos que conforman esta comunidad microbiana promueven el crecimiento y mejoran las defensas de la planta, y otros en cambio, son perjudiciales y causan enfermedades (Brader et al., 2017). Las bacterias son microorganismos capaces de colonizar tanto la superficie como los tejidos internos de las plantas y dependiendo de la zona donde se encuentren pueden clasificarse como bacterias de la rizosfera (zona radicular de la planta), filosfera (superficie aérea de la planta) y endosfera (que habitan en el interior de la planta) (Brader et al., 2017). Algunas especies de bacterias pueden causar enfermedades en un amplio rango de hospederos y generar diferentes síntomas como manchas, clorosis, necrosis, marchitez, pudrición de tejidos, entre otros (Blancard, 2013; Kannan et al., 2016; Strange & Scott, 2005). Las infecciones bacterianas afectan el rendimiento en la producción de los cultivos y causan pérdidas económicas significativas (Kannan et al., 2016; Mansfield et al., 2012), en algunos casos como el de la marchitez bacteriana en tomate que puede alcanzar hasta un 91% en pérdidas de rendimiento (Yuliar et al., 2015). Las enfermedades de origen bacteriano en las plantas son más frecuentes en regiones tropicales y subtropicales, donde las condiciones climáticas cálidas y húmedas son ideales para el crecimiento y dispersión de las bacterias (Kannan et al., 2016; Sundström et al., 2014), lo que genera pérdidas consistentes en los cultivos, especialmente en época lluviosa donde hay mayor incidencia de enfermedades (Brenes et al., 2015; Saborío, 2019). En Costa Rica se produjeron 55,307 toneladas métricas de tomate en el año 2018, sembradas en un área de 1,510 hectáreas (INEC, 2019), distribuidas en siete regiones 10 productoras: Central Occidental, Central Oriental, Central Sur, Pacífico Central, Brunca, Chorotega y Huetar Norte. Las condiciones climáticas del país favorecen la producción de tomate durante todo el año, y a la vez, se favorece el desarrollo y dispersión de enfermedades bacterianas (López-Marín, 2017). La mayoría de las especies de bacterias fitopatógenas se encuentran dentro de las familias Lysobacteraceae (= Xanthomonadaceae) del orden Lysobacterales (= Xanthomonadales), Pseudomonadaceae del orden Pseudomonadales, Burkholderiaceae del orden Burkholderiales, Enterobacteriaceae, Erwiniaceae (anteriormente Enterobacteriaceae) y Pectobacteriaceae (anteriormente Enterobacteriaceae) del orden Enterobacterales (clase Gammaproteobacteria), y la familia Microbacteriaceae del orden Micrococcales (clase Actinomycetes) (Adeolu et al., 2016; Kannan et al., 2016; Tindall, 2014). Una gran variedad de bacterias se ha asociado al cultivo de tomate, tanto patógenas como saprófitas y endófitas. Se ha reportado que algunas especies de los géneros Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas, Clavibacter, Pectobacterium (anteriormente Erwinia), Dickeya (anteriormente Pectobacterium), y Agrobacterium pueden causar enfermedades en las plantas de tomate (Blancard, 2013; Kannan et al., 2016; Samson et al., 2005). Todas las partes de la planta son susceptibles al ataque de bacterias patogénicas. Algunos géneros que infectan las hojas y el fruto son Pseudomonas, Xanthomonas, Clavibacter, Pectobacterium y Dickeya; las raíces pueden ser infectadas por Agrobacterium tumefaciens y A. radiobacter; algunas especies como Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi y varias especies de Pseudomonas como P. corrugata, P. mediterranea, P. cichorii y P. viridiflava infectan la médula del tallo (Catara et al., 2002; Monteiro, 2019; Scarlett et al., 1978; Trantas et al., 2013); y especies como Clavibacter michiganensis, el complejo de especies de Ralstonia solanacearum, y en algunos casos Pectobacterium carotovorum infectan la planta de forma sistémica a través del sistema vascular (Blancard, 2013). En Costa Rica se reportan como las enfermedades más frecuentes en el cultivo de tomate las causadas por especies de Ralstonia, Pseudomonas, Xanthomonas y Pectobacterium (Blanco- Meneses et al., 2023; Cubero-Agüero et al., 2021; MAG, 2024; SFE, 2009). 11 Uno de los aspectos más importantes para el manejo de las enfermedades en un cultivo es el diagnóstico mediante la identificación correcta del agente causal de la enfermedad, que debe realizarse de forma oportuna y precisa (Ramírez- Rojas et al., 2016). La identificación de bacterias en las plantas a menudo se realiza mediante el aislamiento de las bacterias en medios de cultivo no selectivos o semi selectivos, seguido de la identificación de las colonias por sus características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas, o serológicas, así como la ejecución de ensayos de patogenicidad (López et al., 2003; Schaad, 2001). Entre las características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas que sirven en el proceso de distinción de organismos bacterianos se encuentra la forma y el tamaño de sus células, la presencia y disposición de flagelos, características de movilidad y reproducción, estructura y composición de la pared celular, características de las colonias como la forma, el tipo de bordes, la consistencia, pigmentación, la producción de pigmentos difusibles en medios de cultivo determinados, y la capacidad de crecer a ciertas temperaturas, entre otros (Tindall et al., 2007). Las características bioquímicas determinan la respuesta de las bacterias al reaccionar ante ciertos compuestos debido a la actividad enzimática (Lelliott et al., 1966), además de la capacidad para utilizar diferentes fuentes de carbono para su crecimiento, estas características que pueden evaluarse con métodos convencionales o mediante sistemas semiautomatizados como el BiologTM, API® o VITEK® que cuentan con bases de datos para la identificación de ciertas bacterias con base en su perfil fenotípico, aunque la precisión de la identificación depende de las especies en cuestión debido a las limitaciones de cada sistema (Pinot et al., 2011). A pesar de que la caracterización morfológica y bioquímica de cultivos bacterianos es un procedimiento de rutina en los laboratorios, el rápido desarrollo de las técnicas moleculares y genómicas ha simplificado y mejorado la detección e identificación de organismos patógenos (Álvarez, 2004). El uso de técnicas como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con cebadores específicos brinda una alta especificidad y reproducibilidad mediante la amplificación de fragmentos de ADN o ARN para detectar la presencia de 12 especies objetivo de forma rápida y precisa (Álvarez, 2004). Por otra parte, los análisis filogenéticos basados en la secuencia parcial del gen 16S de ARN ribosomal (16S ARNr) han jugado un papel fundamental en la identificación y clasificación taxonómica de las bacterias (Bou et al., 2011; Janda & Abbott, 2007). Este capítulo tuvo como objetivo identificar y caracterizar las bacterias cultivables presentes en plantas de tomate con infecciones bacterianas provenientes de fincas del Valle Central de Costa Rica con la aplicación de técnicas de clasificación morfológica, bioquímica y molecular. Se presenta una base sobre la diversidad de la comunidad bacteriana y se identifican especies de importancia agrícola, algunas clasificadas como potenciales bacterias benéficas y otras debido a la relación con el desarrollo de enfermedades en el cultivo de tomate. 1.2 MATERIALES Y MÉTODOS 1.2.1 Material vegetal y aislamientos bacterianos Se analizaron muestras de tejido de 55 plantas de tomate con diferentes síntomas de enfermedades bacterianas, colectadas entre noviembre de 2021 y octubre de 2023 en siete cantones del Valle Central de Costa Rica (Cuadro 1.1), 51 plantas fueron colectadas en campo de forma dirigida en busca de síntomas de infecciones bacterianas, y cuatro plantas fueron recibidas como parte del servicio de diagnóstico ofrecido por el Laboratorio de Técnicas Moleculares del Centro de Investigación en Protección de Cultivos (CIPROC-UCR). El procesamiento de las muestras de tomate se realizó en el laboratorio de Fitopatología del CIPROC-UCR. Se seleccionaron de una a cinco submuestras de cada planta dependiendo de la cantidad y distribución de los síntomas para un total de 143 submuestras de tejido; se realizó la desinfección superficial en solución de hipoclorito de sodio al 1% por 30 s, alcohol al 70% por 1 min y tres lavados con agua destilada. Cada submuestra se dividió en dos partes iguales después de la desinfección, una parte destinada al macerado para realizar los 13 aislamientos bacterianos y la otra parte destinada a la extracción de ADN a partir de tejido para la detección de bacterias mediante PCR con cebadores específicos. Se extrajo el tejido interno de las secciones de tallo y follaje destinadas al macerado utilizando un bisturí estéril sobre una lámina de vidrio esterilizada mediante flameado, se cortaron secciones de 2-5 mm del tejido y se depositaron en tubos de ensayo con 3 ml de solución salina al 0.85% estéril; el tejido se maceró con un agitador de vidrio estéril y se dejó en reposo de 5-10 min. Posteriormente, con un asa bacteriológica estéril se tomó una gota del macerado homogéneo y se rayó en platos Petri de plástico de 90x15 mm estériles con medio de cultivo de agar nutritivo (AN) OXOID Ltd. CM0003 28 g/L (Thermo ScientificTM). Los platos se incubaron de forma invertida a 28°C ± 2°C por 24-72 horas o hasta observar el crecimiento de colonias bacterianas separadas. Cuadro 1.1 Procedencia y síntomas de infecciones bacterianas observados en plantas de tomate colectadas en el Valle Central de Costa Rica. Se indica el número de muestras de tejido que fueron evaluadas por cada planta, así como el número de aislamientos obtenidos de cada planta. ID de Planta Cantón Provincia Vara Síntomas Tejido analizado MTb Asc LTM_11 Paraíso Cartago JR Peca bacteriana en hojas Hoja 1 – LTM_12 Paraíso Cartago JR Hojas cloróticas; necrosis en tallo y hojas; tallo hueco Base del tallo; tallo inferior 2 1 LTM_13 Paraíso Cartago 7810 Necrosis en tallo; tallo hueco Tallo superior 2 3 LTM_14 Paraíso Cartago 7810 Lesiones necróticas en tallo; tallo hueco Tallo inferior; tallo superior 2 4 LTM_15 Paraíso Cartago Cherry grape Marchitez general Tallo inferior; tallo superior 2 – LTM_16 Turrialba Cartago NDd Peca bacteriana en hojas; lesión necrótica en raíz y tallo; tallo hueco Raíz; base del tallo; hoja 4 – LTM_17 Turrialba Cartago ND Lesiones necróticas en hojas y tallo superior Tallo superior; hoja 3 – LTM_18 Turrialba Cartago ND Necrosis acuosa en tallo inferior; marchitez Base del tallo; hoja 2 – 14 ID de Planta Cantón Provincia Vara Síntomas Tejido analizado MTb Asc LTM_19 Turrialba Cartago ND Necrosis interna en raíz y tallo inferior; hojas marchitas y con manchas marrones Raíz; tallo inferior; hoja 3 – LTM_20 Turrialba Cartago ND Peca bacteriana en hojas Hoja 1 – LTM_21 Turrialba Cartago ND Lesiones acuosas y hundidas en fruto Fruto 3 2 LTM_22 Turrialba Cartago Vulcano Necrosis en base del tallo y tallo superior; marchitez Base del tallo; tallo superior 2 5 LTM_23 Alvarado Cartago JR Necrosis en base del tallo; tallo hueco; marchitez Base del tallo; hoja 2 5 LTM_24 Alvarado Cartago JR Necrosis en base del tallo; marchitez Base del tallo; hoja 2 7 LTM_25 Alvarado Cartago JR Necrosis en raíz y base del tallo; marchitez Base del tallo; hoja 2 6 LTM_28 Paraíso Cartago Armada + Milán Necrosis en tallo inferior; tallo hueco Tallo inferior 2 3 LTM_29 Paraíso Cartago Armada + Milán Necrosis acuosa en tallo superior; tallo hueco Tallo superior 1 1 LTM_30 Alajuela Alajuela Green rise + 7810 Necrosis acuosa en tallo inferior y tallo superior; tallo hueco; marchitez Tallo inferior; tallo superior; hoja 4 5 LTM_32 Alajuela Alajuela Green rise + 7810 Necrosis acuosa en tallo inferior y tallo superior; tallo hueco; marchitez Tallo inferior; tallo superior; hoja 3 4 LTM_33 Alajuela Alajuela Green rise + 7810 Necrosis seca y acuosa en tallo inferior y tallo superior; tallo hueco; marchitez Tallo inferior; tallo superior; hoja 4 6 LTM_34 Zarcero Alajuela JR Marchitez general Tallo inferior; hoja 2 – LTM_35 Zarcero Alajuela JR Necrosis y agrietamiento en base del tallo; tallo hueco Base del tallo; tallo inferior 5 – LTM_36 Zarcero Alajuela JR Puntos grises con apariencia de chancros en fruto Fruto 1 – LTM_37 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en base del tallo; tallo hueco; marchitez Base del tallo; hoja 2 1 LTM_38 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en base del tallo; tallo hueco; marchitez Base del tallo; hoja 2 1 LTM_39 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en base del tallo; tallo hueco; marchitez Base del tallo; hoja 2 1 LTM_40 Alajuela Alajuela 7810 Necrosis acuosa en raíz, base del tallo, tallo inferior y tallo superior; clorosis y marchitez Raíz; base del tallo; tallo inferior; tallo superior; hoja 5 6 15 ID de Planta Cantón Provincia Vara Síntomas Tejido analizado MTb Asc LTM_41 Alajuela Alajuela TD1 + 7810 Necrosis en base del tallo, tallo superior y hojas; tallo hueco Base del tallo; tallo inferior; tallo superior; hoja 4 4 LTM_42 Alajuela Alajuela ND Necrosis en base del tallo; marchitez Base del tallo 1 1 LTM_46 Alajuela Alajuela Green rise + 7810 Lesión agrietada en base del tallo y tallo inferior; marchitez Base del tallo; tallo inferior; hoja 3 1 LTM_47 Alajuela Alajuela TD1 + Toreto Necrosis acuosa en base del tallo y tallo inferior; marchitez Base del tallo 1 – LTM_48 Alajuela Alajuela TD1 + Toreto Necrosis acuosa en base del tallo y tallo inferior; marchitez Base del tallo; hoja 2 – LTM_49 Zarcero Alajuela JR Necrosis interna y externa en base del tallo; tallo hueco Base del tallo 2 2 LTM_50 Zarcero Alajuela JR Necrosis en base del tallo, tallo inferior y tallo superior; marchitez Base del tallo; tallo superior; hoja 3 3 LTM_51 Zarcero Alajuela JR Necrosis interna en base del tallo y tallo inferior; clorosis Base del tallo; tallo inferior; hoja 3 3 LTM_52 Zarcero Alajuela JR Necrosis y agrietamiento en base del tallo, tallo inferior y tallo superior; marchitez Base del tallo; tallo inferior; tallo superior; hoja 4 4 LTM_53 Alajuela Alajuela 7810 Pudrición acuosa en tallo inferior y tallo superior; marchitez Tallo inferior; tallo superior; hoja 5 – LTM_58 Barva Heredia 8565 Necrosis en base del tallo; clorosis y marchitez Base del tallo; hoja 2 4 LTM_59 Barva Heredia 8565 Necrosis en base del tallo, tallo inferior, tallo superior y hojas; clorosis y marchitez Raíz; base del tallo; tallo inferior; tallo superior; hoja 5 8 LTM_60 Barva Heredia 8565 Necrosis en base del tallo, tallo inferior y tallo superior; marchitez Base del tallo; tallo inferior; tallo superior; hoja 4 7 LTM_61 Barva Heredia 8565 Peca bacteriana en hojas; necrosis; clorosis; marchitez Hoja 1 1 LTM_62 Barva Heredia 8565 Peca bacteriana en hojas; necrosis; clorosis; marchitez Hoja 1 2 LTM_63 Barva Heredia 8565 Necrosis seca en base del tallo, tallo inferior y hojas; clorosis y marchitez Base del tallo; tallo inferior; hoja 4 9 LTM_64 Barva Heredia 8565 Necrosis seca en base del tallo y hojas; clorosis y marchitez Base del tallo; hoja 2 4 16 ID de Planta Cantón Provincia Vara Síntomas Tejido analizado MTb Asc LTM_65 Barva Heredia 8565 Peca bacteriana en hojas; clorosis y marchitez Hoja 1 3 LTM_66 Alajuela Alajuela Dionisio Necrosis y pudrición en la base del tallo Base del tallo 2 – LTM_67 Alajuela Alajuela Dionisio Necrosis en base del tallo; lesiones necróticas con halo clorótico en hojas Base del tallo; hoja 2 – LTM_68 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en raíz y base del tallo; tallo hueco; marchitez Raíz; base del tallo; hoja 3 4 LTM_69 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en raíz y base del tallo; tallo hueco; marchitez Raíz; base del tallo; hoja 3 3 LTM_70 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis seca y acuosa en raíz, base del tallo y tallo superior; marchitez Raíz; base del tallo; tallo superior; hoja 4 6 LTM_71 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis seca y acuosa en raíz y base del tallo; marchitez Raíz; base del tallo; hoja 3 3 LTM_72 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis seca y acuosa en base del tallo y tallo inferior; marchitez Base del tallo; tallo inferior; hoja 3 2 LTM_73 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis acuosa en raíz y base del tallo; marchitez Raíz; base del tallo; hoja 3 – LTM_74 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en raíz y base del tallo; marchitez Raíz; base del tallo; hoja 3 4 LTM_78 Santa Bárbara Heredia 8565 Clorosis y manchas necróticas secas y acuosas en hojas Hoja 3 7 Total 143 146 aVar = variedad de tomate. bMT = muestras de tejido evaluadas por cada planta. cAs = Número de cultivos puros aislados a partir de las muestras de tejido. dND = variedad desconocida. LTM = Laboratorio de Técnicas Moleculares CIPROC- UCR. No se obtuvieron aislamientos viables (–). 1.2.2 Descripciones morfológicas Se realizó el subcultivo para la purificación de los aislamientos mediante el rayado de las colonias separadas de los cultivos originales en medio de AN nuevo y se incubó a 28°C ± 2°C por 24-48 horas. Se obtuvieron 146 aislamientos puros, se describieron las características morfológicas observables a simple vista de las colonias, como la forma (circular, puntiforme, irregular, filamentosa), 17 los bordes o márgenes (enteros, ondulados, lobulados, filamentosos), la elevación en el medio de cultivo (elevadas, planas, convexas, umbonadas), la textura y consistencia (lisas, concéntricas, rugosas, mucoides), el color de las colonias y el comportamiento óptico frente a la luz transmitida (opacas, translúcidas) y frente a la luz reflejada (brillantes, opacas). También se midió el diámetro de las colonias y se calculó la media con tres repeticiones para agrupar las cepas por su tamaño como grandes (≥ 3 mm de diámetro) y pequeñas (< 3 mm de diámetro) (Sousa et al., 2013). Los cultivos puros se conservaron en tubos Eppendorf de 2 ml con 1.5 ml de caldo nutritivo OXOID Ltd. CM0001 13 g/L (Thermo ScientificTM) con 35% de glicerol bajo congelación a -80°C, y estos fueron utilizados para las pruebas posteriores. 1.2.3 Pruebas fisiológicas y bioquímicas Se realizaron diferentes pruebas fisiológicas y bioquímicas convencionales para generar un perfil general de los aislamientos bacterianos. Las pruebas realizadas fueron la tinción de Gram, hidróxido de potasio (KOH 3%), oxidasa, catalasa y la verificación de crecimiento en medios diferenciales y semiselectivos. Se utilizaron controles positivos y negativos correspondientes en las diferentes pruebas para la interpretación de los resultados. 1.2.3.1 Tinción de Gram Se realizó la tinción de Gram a los aislamientos puros para separar las bacterias con base en una coloración diferencial, debida a la composición y estructura de la pared celular. Se realizó un frotis bacteriano de cada aislamiento en láminas portaobjetos con una gota de agua destilada, se dejó secar a temperatura ambiente y se fijó al portaobjetos con un mechero de alcohol por 2-3 s, después se aplicó cristal violeta (solución Gram-Hucker), se dejó reposar por 30 s, y se lavó con agua destilada. Luego se aplicó lugol (con 0.4% de yodo diluido), se dejó reposar por 1 min, y se lavó con agua destilada. Después se decoloró con alcohol-acetona (7:3) y se lavó inmediatamente con agua destilada; el proceso de decoloración se repitió hasta que el frotis dejara de liberar el colorante. Por 18 último, se aplicó safranina (solución Gram-Hucker), se dejó reposar por 30 s, se lavó con agua destilada y se dejó secar a temperatura ambiente. Cada lámina se observó en un microscopio óptico con una amplificación de 1,000 veces (aumento de 100X con inmersión en aceite). Para todos los aislamientos bacterianos se registró si las bacterias eran Gram positivas cuando se observó una coloración violeta en las células, o Gram negativas cuando se observó una coloración rosada, así como la forma de sus células (bacilos, cocos, cocobacilos). 1.2.3.2 Prueba de hidróxido de potasio (KOH 3%) Esta prueba se realizó de forma complementaria a la tinción de Gram. Con el asa bacteriológica estéril se tomó una colonia separada de cada cultivo puro y se frotó en una gota de KOH al 3% en una lámina portaobjetos y se mezcló durante 10-20 s, luego se tocó y levantó con un palillo de madera estéril para observar si se formaba un hilo viscoso. Las bacterias Gram negativas tienen una pared celular más delgada que las Gram positivas, y al contacto con el KOH, la pared celular se rompe y el contenido celular se libera en la gota de KOH volviéndola viscosa (Gregersen, 1978). Si se observó la formación del hilo viscoso al levantar el palillo de madera se determinó una reacción KOH positiva (bacteria Gram negativa), de lo contrario, la reacción se determinó como KOH negativa (bacteria Gram positiva). Se realizó un análisis de correlación de Pearson entre la tinción de Gram y la prueba de KOH 3% en el entorno de R (R Core Team, 2024). 1.2.3.3 Prueba de oxidasa La prueba de oxidasa consistió en frotar una colonia bacteriana de cada aislamiento con un palillo de madera estéril sobre una tira reactiva de oxidasa OXOID Ltd. (MicrobactTM, Thermo ScientificTM) para identificar bacterias que producen la enzima citocromo c oxidasa, que interviene en la cadena de transporte de electrones. Las bacterias oxidasa positivas son aeróbicas y pueden usar oxígeno como aceptor terminal de electrones en la respiración 19 celular y oxidan el reactivo de las tiras provocando un viraje de color a un tono azul-violeta. Las bacterias oxidasa negativas pueden ser anaeróbicas, aeróbicas o facultativas, y no producen la enzima citocromo oxidasa que oxida el reactivo de prueba, por lo tanto, no hay cambio de coloración. Se observó la reacción durante 5-10 s, un color azul-violeta intensó indicó que la reacción fue positiva, de lo contrario, la reacción resultó negativa. 1.2.3.4 Prueba de catalasa La prueba de catalasa consistió en frotar una colonia de cada aislamiento con un asa bacteriológica en una gota de peróxido de hidrógeno sobre un portaobjetos para observar la formación de burbujas (catalasa positiva), o la ausencia de burbujas (catalasa negativa). Las bacterias catalasa positivas tienen la enzima catalasa, que es generalmente producida por bacterias que respiran usando oxígeno y que las protege de los subproductos tóxicos del metabolismo del oxígeno. Estas bacterias pueden ser aeróbicas estrictas o anaeróbicas facultativas, pero todas tienen la capacidad de respirar utilizando oxígeno como aceptor terminal de electrones. Las bacterias catalasa negativas por su parte, pueden ser anaeróbicas o anaeróbicas facultativas que solo fermentan y pueden respirar utilizando otros aceptores finales de electrones en la cadena respiratoria distintos al oxígeno. 1.2.3.5 Características de crecimiento en medios semiselectivos y diferenciales Como parte de la caracterización bioquímica, se realizaron cultivos de bacterias en medios semiselectivos y diferenciales para evaluar las características del crecimiento de las colonias en presencia de ciertos compuestos. Los cultivos se realizaron mediante el rayado de bacterias a partir de los cultivos puros. Los medios que se utilizaron fueron el medio B de King (KB), el medio de agar MacConkey y el medio triple azúcar hierro (TSI). El medio KB, compuesto de glicerol 92.1 g/mol 15 ml/L (Merck); peptona bacteriológica OXOID Ltd. LP0037 10 g/L (Thermo ScientificTM); agar bacteriológico OXOID Ltd. LP0011 20 g/L (Thermo ScientificTM); fosfato 20 dipotásico anhídrido (K2HPO4) 174.18 g/mol 1.5 g/L (Merck); y sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4·7H2O) 246.48 g/mol 1.5 g/L (Merck), fue utilizado para diferenciar entre bacterias que liberan pigmentos fluorescentes y no fluorescentes observadas en un transiluminador ultravioleta (King et al., 1954). El medio de agar MacConkey OXOID Ltd. CM0115 51.5 g/L (Thermo ScientificTM) es selectivo para bacterias Gram negativas y permite diferenciar entre bacterias fermentadoras de lactosa y no fermentadoras de lactosa. Las bacterias fermentadoras de lactosa se identifican mediante el viraje de color del indicador de pH rojo neutro, la absorción en las colonias que adquieren una coloración roja-rosada, y en algunos casos la precipitación de sales biliares. Las bacterias no fermentadoras de lactosa producen colonias incoloras (Flournoy et al., 1990). El medio TSI OXOID Ltd. CM00277 65 g/L (Thermo ScientificTM) es un medio diferencial utilizado para clasificar las bacterias en función de su fermentación de lactosa, glucosa y/o sacarosa con base en los cambios de coloración del medio después de la incubación, así como la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) en forma de un precipitado color negro en el medio, y la producción de gas (CO2) en forma de burbujas de aire o incluso la separación del medio. Se utilizaron tubos de ensayo en los que se dispensaron 5 ml del medio líquido y se dejó gelificar con una inclinación de 45° para obtener una proporción de 3:1 del fondo sobre la parte inclinada. Los cultivos puros se rayaron en cada uno de los medios y se incubaron a 28°C ± 2°C durante 24-48 horas. Posteriormente, se describieron las características de crecimiento en cada medio, como la forma de las colonias, el color y la textura, así como los virajes de color en el medio. La siembra en el medio TSI se realizó con una aguja bacteriológica mediante punción al fondo del medio y al retirarla se rayó la bacteria en la sección inclinada de la parte superior. La interpretación de los aislamientos en el medio TSI se realizó de acuerdo con Lehman (2005) después de la incubación. 21 1.2.3.6 Perfil bioquímico en el sistema VITEK® 2 Con el fin de generar un perfil bioquímico más robusto, se utilizaron las tarjetas de identificación GN para bacterias Gram negativas en el sistema VITEK® 2 (bioMérieux) del laboratorio de Bacteriología Médica de la Facultad de Microbiología UCR. Las tarjetas GN incorporan 47 pruebas bioquímicas estándar que determinan la utilización de fuentes de carbono, actividad enzimática y resistencia a ciertos compuestos (Pincus, 2006). Se seleccionaron 17 cepas bacterianas con base en la viabilidad de los aislamientos y la tinción de Gram para realizar dichas pruebas. Las cepas seleccionadas se rayaron en medio de agar tripticasa-soya (ATS) y se incubaron a 35°C ± 2°C por 24 horas. Luego se realizó una suspensión de cada cultivo en tubos de 5 ml con 3 ml de solución salina al 0.45%; la suspensión se llevó a una turbidez de 0.50-0.63 en escala de McFarland, medida con el turbidímetro DensiCheckTM (bioMérieux). Los tubos con las suspensiones bacterianas se cargaron en las gradillas del equipo, se colocaron las tarjetas GN y se ingresó en el sistema VITEK® 2 para las lecturas respectivas de forma automática. El sistema utilizó un periodo de incubación ≤ 10 horas a 35.5°C ± 1°C, con una toma de datos en intervalos de 15 min durante el periodo completo de incubación. La revisión de las lecturas se realizó al día siguiente de la introducción. Se realizó un análisis de agrupamiento aglomerativo jerárquico mediante la combinación de las pruebas convencionales y el perfil generado en el sistema VITEK® 2 para las 18 cepas evaluadas con el fin de determinar la disimilitud entre ellas mediante el cálculo de una matriz de distancias eucledianas y el método aglomerativo de Ward con el número óptimo de “clusters”, a través del paquete ‘factoextra’ (Kassambara & Mundt, 2020) en el entorno de R (R Core Team, 2024). 22 1.2.4 Análisis molecular 1.2.4.1 Extracción de ADN de tejido sintomático y de cultivos puros La extracción de ADN de muestras de tejido fresco se realizó mediante el protocolo CTAB (Doyle & Doyle, 1990) con las modificaciones de Trout et al. (1997). Las submuestras cortadas en fragmentos pequeños se colocaron en cápsulas individuales con dos balines de acero y se maceró en el molino mezclador MM 400 (Retsch) con una frecuencia de oscilación de 23 Hz durante 2.5 min, luego se tomó una punta de espátula del macerado homogéneo y se colocó en tubos Eppendorf de 1.5 ml con 150 µl de buffer de extracción (sorbitol 0.35 M; Tris HCl 0.1 M pH 7.5; EDTA 0.005 M pH 8; bisulfito de sodio 0.02 M; agua destilada estéril) y 150 µl de buffer de lisis (NaCl 2 M; Tris HCl 0.2 M pH 7.5; EDTA 0.05 M pH 8; CTAB 2%; agua destilada estéril). Los tubos se agitaron en un vórtex durante 15 s y se colocaron en un calentador de bloque de baño en seco a 65°C durante 60 min. Después de la incubación se agregó 300 µl de cloroformo isoamil-alcohol 24:1 (Sigma-Aldrich) en una cámara de extracción de gases; los tubos se agitaron de forma manual y se centrifugaron a 14,000 revoluciones por minuto (rpm) durante 15 min para separar las fases. La fase acuosa (sobrenadante) se transfirió a un tubo nuevo y se agregó 300 µl de cloroformo isoamil-alcohol 24:1 para una segunda centrifugación a 14,000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo donde se agregó 300 µl de etanol puro al 95% frío y 20 µl de acetato de sodio 3 M, luego se agitó manualmente y se dejó precipitar el ADN a -20°C durante toda la noche. Después de la precipitación, los tubos se centrifugaron a 14,000 rpm durante 20 minutos y se descartó el etanol al 95% y el acetato de sodio 3 M decantando los tubos en un beaker, luego se realizó el lavado del precipitado de ADN con 150 µl de etanol al 70% frío y se centrifugó a 12,000 rpm durante 10 min, luego se descartó el etanol al 70% decantando los tubos en un beaker y se dejó evaporar el remanente con los tubos abiertos dentro de la cámara de flujo laminar. Una vez evaporado el etanol, el precipitado de ADN se resuspendió con 50 μl de buffer TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) y se conservó a -20°C. El ADN 23 de cada muestra se cuantificó en nanogramos por microlitro (ng/µl) con un espectrofotómetro de microvolúmenes NanoDropTM One (Thermo ScientificTM), y se verificó la calidad del ADN con la relación de absorbancia A260/A280 nanómetros (nm) y A260/A230 nm mediante tres lecturas para cada muestra. Debido a que se registraron concentraciones elevadas de ADN genómico, se realizaron diluciones seriadas de 1:10, 1:50, 1:100 y 1:500 para utilizarlas en las pruebas de PCR. La extracción de ADN de los cultivos puros se realizó con el mismo protocolo utilizado para la extracción de ADN de tejido con algunos cambios, como la omisión del macerado, ya que las colonias bacterianas se depositaron directamente en los tubos con el buffer de extracción y el buffer de lisis con un asa bacteriológica estéril, después se agitó en un vortex por 15 s y se llevó a incubación en el calentador de bloque a 55°C por 60 min. Las centrifugaciones se realizaron a 12,000 rpm con los tiempos correspondientes indicados en la extracción de ADN de tejido. Además, se realizaron dos lavados con etanol al 70% en lugar de uno. El precipitado de ADN se resuspendió con 50 μl de buffer TE y se conservó a -20°C. También se cuantificó y se verificó la calidad del ADN en el espectrofotómetro de microvolúmenes con tres repeticiones para cada muestra. Tanto para las amplificaciones de ADN de las muestras de tejido como para el ADN de los cultivos puros se utilizó una concentración de 20-100 ng/µl. 1.2.4.2 Detección de bacterias fitopatógenas con cebadores específicos Para detectar la presencia de bacterias fitopatógenas en el tejido sintomático de plantas de tomate se realizó la amplificación de fragmentos de ADN mediante PCR de tiempo final con cebadores específicos (Cuadro 1.2). El volumen final de cada reacción fue de 25 µl y contenía 2.5 μl de Dream Taq buffer 10X con 2 mM de MgCl2 (Thermo ScientificTM), 2.5 μl de dNTP mix 2 mM (Thermo ScientificTM), 1.25 μl de cada cebador 100 μM, 0.25 μl de Dream Taq ADN polimerasa 5 U/μl (Thermo ScientificTM), 1 μl de ADN y 16.25 μl de agua ultrapura. 24 Las reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con los perfiles térmicos de cada par de cebadores. Para los cebadores CMM5/CMM6, Ps-for/Ps-rev, MM5F/MM5R, Xc-lip-F2/Xc-lip-R2, RST21/RST22 y EXPCCF/EXPCCR se utilizó un perfil de un ciclo de desnaturalización inicial a 94°C por 2 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 1 min, anillamiento a la temperatura requerida de cada marcador por 1 min (Cuadro 1.2), extensión a 72°C por 1 min, un ciclo de extensión final a 72°C por 7 min y mantenimiento a 4°C (Dreier et al., 1995; Kang et al., 2003; Lee et al., 2009; Leite et al., 1994; Widmer et al., 1998; Zaccardelli et al., 2005). Para los cebadores PC1/1-PC1/2 y PC5/1-PC5/2 el perfil consistió en un ciclo de desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, seguido de 30 ciclos de 30 s a 94°C, 1 min a 62°C y 1.5 min a 72°C, con un ciclo de extensión final de 5 min a 72°C (Trantas et al., 2015). Para los cebadores ADE1/ADE2 el perfil utilizado consistió en un ciclo de desnaturalización inicial a 94°C por 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94°C y 1 min a 72°C, con un ciclo de extensión final a 72°C por 10 min (Nassar et al., 1996; Tsror Lahkim et al., 2012). Después de cada PCR se verificó la amplificación de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa Top Vision (Thermo ScientificTM) al 1% en buffer TBE 0.5X (Thermo ScientificTM) con un voltaje de 95-100 voltios durante 35 min. Para teñir los fragmentos de ADN amplificados se utilizó 1.5 μl de buffer de carga 6X DNA Loading Dye (Thermo ScientificTM) para 5 μl de cada producto de PCR. Para comprobar el tamaño de la banda de ADN se colocó 1.5 μl de GeneRuler 100 bp plus DNA Ladder (Thermo ScientificTM). Una vez terminada la corrida de electroforesis, se observó el gel en un transiluminador ultravioleta. Se confirmó la presencia de las bacterias con la observación de las bandas del tamaño respectivo para cada par de cebadores (Cuadro 1.2). Con los datos de presencia y ausencia se calculó la frecuencia de ocurrencia de las especies o géneros bacterianos encontrados por planta en cada cantón de muestreo y se generó un mapa de distribución de las bacterias en el país, con gráficos de frecuencia anidados que toman en cuenta las detecciones y la coexistencia de diferentes bacterias por planta. Los gráficos de frecuencia y el 25 mapa de distribución se generaron en el entorno de R (R Core Team, 2024) con los paquetes ‘sunburstR’, ‘sf’ y ‘ggplot2’ (Bostock et al., 2023; Pebesma, 2018; Wickham, 2016). Cuadro 1.2 Cebadores específicos utilizados para detectar la presencia de bacterias patógenas en tejido de plantas de tomate con síntomas de infecciones bacterianas colectadas en fincas del Valle Central de Costa Rica. Especie/Género Cebador Blanco Secuencia (5’-3’) T.a1 (°C) Tamaño (pb2) Fuente Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis CMM5 pat-1 GCGAATAAGCCCATAT CAA 55 614 Dreier et al. (1995) CMM6 CGTCAGGAGGTCGCC TAATA Pseudomonas sp. Ps-for 16S ARNr GGTCTGAGAGGATGAT CAGT 66 1007 Widmer et al. (1998) Ps-rev TTAGCTCCACCTCGCG GC Pseudomonas mediterranea PC1/1 pAV619 GGATATGAGCCAGGTC TTCG 62 600 Catara et al. (2002) PC1/2 CGCTCAAGCGCGACTT CAG Pseudomonas corrugata PC5/1 pAV620 CCACAGGACAACATGT CCAC 62 1100 Catara et al. (2000; 2002) PC5/2 CAGGCGCTTTCTGGAA CATG Pseudomonas syringae pv. tomato MM5F hrpZPst GAACGAGCTGAAGGA AGACA 57 532 Zaccardelli et al. (2005) MM5R CAGCCTGGTTAGTCTG GTTA Xanthomonas sp. Xc-lip-F2 estA TATGTGATGGTGCCGA CCATTC 57 777 Lee et al. (2009) Xc-lip-R2 GGACTTCGCGGTCCA CGTCGTAGC Xanthomonas vesicatoria (= X. campestris pv. vesicatoria) RST21 hrpD GCACGCTCCAGATCAG CATCGAGG 61 1075 Leite et al., (1994) RST22 GGCATCTGCATGCGTG CTCTCCGA Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum EXPCCF pECC2F GAACTTCGCACCGCC GACCTTCTA 60 550 Kang et al. (2003) EXPCCR GCCGTAATTGCCTACC TGCTTAAG Dickeya chrysanthemi ADE1 pelADE GATCAGAAAGCCCGCA GCCAGAT 72 420 Nassar et al. (1996) ADE2 CTGTGGCCGATCAGG ATGGTTTTGTCGTGC 1T.a: Temperatura de anillamiento (°C); 2pb: Tamaño de banda del producto de PCR en pares de bases. 26 1.2.4.3 Identificación de aislamientos con la secuenciación parcial del gen 16S ARNr Con el fin de identificar las bacterias aisladas del tejido sintomático se realizó la amplificación parcial del gen 16S de ARN ribosomal (16S ARNr) de 61 aislamientos bacterianos mediante PCR de tiempo final con los cebadores universales F27 (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) y 1492R (5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) (Lane, 1991) en un volumen final de 25 µl por cada reacción, que contenía 2.5 µl de Dream Taq buffer 10X (Thermo ScientificTM), 2.5 µl de dNTP mix 2 mM (Thermo ScientificTM), 1.25 µl de cada marcador 100 µM, 0.25 µl de Dream Taq ADN polimerasa 5 U/µl (Thermo ScientificTM), 1 µl de la muestra de ADN, y agua ultrapura para completar el volumen. El perfil térmico consistió en un ciclo de desnaturalización inicial a 94°C por 2 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 1 min, anillamiento a 56°C por 1 min, extensión a 72°C por 1 min, extensión final a 72°C por 7 min, y mantenimiento a 4°C. Se realizaron electroforesis en gel de agarosa al 1% para verificar la amplificación de ADN con fragmentos de 1,500 pb aproximadamente. Se realizó la purificación de los productos de PCR con 1.5 µl de Exonucleasa 1 (20 U/µl) (Thermo ScientificTM) y 3 µl de buffer de reacción 10X por cada 15 µl del producto de PCR, luego se llevó al termociclador con un perfil de activación de la enzima a 37°C por 15 min y un ciclo final a 85°C por 15 min. Una vez purificados los productos de PCR, se enviaron a la compañía Macrogen, Inc. (Seúl, Corea del Sur) para la secuenciación de las muestras con el método Sanger (Sanger et al., 1977; Sanger & Coulson, 1975; Slatko et al., 2018). El recorte, edición y generación de las secuencias consenso se realizó en BioEdit v.7.0.5.3 (Hall, 1999). Las secuencias fueron comparadas en la base de datos de GenBank del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) mediante la herramienta BLAST Nucleotide (Zhang et al., 2000) con una búsqueda limitada a secuencias de cepas tipo. Para la reconstrucción filogenética se descargaron secuencias parciales del gen 16S ARNr de cepas tipo de especies válidamente publicadas de acuerdo con el Listado de nombres Procariotas con Posición en Nomenclatura (LPSN) (Cuadro S1.1). El 27 alineamiento de las secuencias se realizó en MAFFT v. 7 (Katoh et al., 2017) con parámetros por defecto. El tamaño final de las secuencias alineadas y recortadas fue de 1,384 pares de bases (pb). Se utilizó JModelTest v.2.1.10 (Darriba et al., 2012) para determinar el mejor modelo de sustitución nucleotídica. El árbol filogenético se realizó mediante inferencia Bayesiana en MrBayes v. 3.2.6 (Ronquist et al., 2012). Se corrieron cuatro cadenas con el modelo de sustitución nucleotídica de tiempo general reversible con distribución gamma más sitios invariantes (GTR+I+G) y se ejecutaron 1,000,000 generaciones de cadenas de Markov Monte Carlo (mcmc) y 1,000 generaciones de frecuencia de muestreo de árboles, con un calentamiento (“burnin”) del 25% de las cadenas. Se utilizó la cepa Bacillus subtilis IAM 12118T como grupo externo. El árbol consenso se visualizó y editó en iTOL v.6.9.1 (Letunic & Bork, 2024). Las secuencias analizadas en este estudio fueron depositadas en la base de datos del GenBank bajo las accesiones PQ857593-PQ857653. Con la identificación de los géneros y las características morfológicas y bioquímicas de los aislamientos evaluadas mediante métodos convencionales, se elaboró un diagrama de Sankey con el paquete ‘ggsankey’ (Sjoberg, 2024) en el entorno de R (R Core Team, 2024) con el fin de visualizar el flujo de las características hacia los géneros identificados y apreciar la proporción de los aislamientos con características específicas. 1.3 RESULTADOS 1.3.1 Caracterización morfológica de los aislamientos Se caracterizó la morfología de las colonias de 146 cultivos puros aislados a partir de muestras de tejido sintomático de plantas de tomate provenientes de siete cantones del Valle Central de Costa Rica. Los aislamientos se caracterizaron después de 24-72 horas de crecimiento en medio de agar nutritivo (AN) incubado a 28°C ± 2°C. Respecto a la forma de las colonias, 109 aislamientos (74.66%) presentaron forma circular, 21 aislamientos (14.38%) 28 forma irregular y 16 aislamientos (10.96%) puntiformes; 115 aislamientos (78.77%) presentaron bordes enteros, 22 (15.03%) fueron ondulados y nueve (6.16%) fueron lobulados; en cuanto a la elevación de las colonias en el medio, dos aislamientos (1.37%) presentaron colonias convexas, 88 (60.27%) colonias elevadas, 54 (36.99%) colonias planas y dos (1.37%) colonias umbonadas. Los aislamientos presentaron una amplia diversidad de coloraciones y tonalidades, 72 aislamientos (49.32%) presentaron tonalidades en color amarillo, 32 aislamientos (21.92%) color blanco, 13 aislamientos (8.90%) color crema, 18 aislamientos (12.24%) color naranja, seis (4.11%) color rosado, y cinco aislamientos (3.42%) incoloros o transparentes (Cuadro 1.3). En cuanto a la consistencia y textura, 137 aislamientos (93.84%) presentaron colonias lisas, tres (2.05%) mucoides y seis (4.11%) rugosas. El comportamiento óptico de las colonias se evaluó frente a la luz emitida en donde 104 aislamientos (71.23%) presentaron colonias opacas y 42 aislamientos (28.77%) con colonias translúcidas; frente a la luz reflejada 145 aislamientos (99.32%) presentaron colonias brillantes y uno (0.68%) presentó colonias opacas. El tamaño de las colonias bacterianas presentó un rango de 0.3-6.01 mm de diámetro, con una media = 1.86 mm; desviación estándar (SD) = 1.02 mm; error estándar (SE) = 0.08 mm. Las colonias se agruparon por su tamaño como grandes (≥ 3 mm de diámetro) y pequeñas (< 3 mm de diámetro); 18 aislamientos (12.33%) presentaron colonias grandes y 128 aislamientos (87.67%) colonias pequeñas (Cuadro 1.3). 1.3.2 Caracterización fisiológica y bioquímica de los aislamientos Se realizó la caracterización fisiológica y bioquímica de las cepas bacterianas mediante pruebas convencionales. Según la tinción de Gram se identificaron 46 aislamientos (31.51%) como Gram negativos, de estos 43 fueron bacilos y 3 fueron cocos; se identificaron 87 aislamientos (59.59%) como Gram positivos, 29 bacilos y 58 cocos; y 13 aislamientos (8.90%) como no determinados (ND). En la prueba de KOH 3% se registraron 42 cepas (28.77%) KOH positivas y 104 (71.23%) KOH negativas. La correlación entre la tinción de Gram y la prueba de 29 KOH 3% fue estadísticamente significativa, con un r = -0.83; intervalo de confianza al 95% (IC95%) = -0.88, -0.77; p < 0.001. En la prueba de oxidasa se registraron 30 cepas (20.55%) con una reacción positiva y 116 (79.45%) con una reacción negativa. En la prueba de catalasa 133 cepas (91.10%) presentaron reacciones positivas y 13 cepas (8.90%) presentaron una reacción negativa. En el medio B de King (KB), 21 cepas (14.38%) liberaron pigmentos difusibles fluorescentes en el medio, 91 (62.33%) no liberaron pigmentos fluorescentes y 34 (23.29%) no fueron determinadas (ND). En cuanto al crecimiento en medio de agar MacConkey y la fermentación de lactosa, 35 cepas (23.97%) crecieron en el medio y fueron no fermentadoras de lactosa, 85 cepas (58.22%) no crecieron en el medio y 26 cepas (17.81%) no fueron evaluadas en la prueba (ND) (Cuadro 1.3). En la prueba del medio triple azúcar hierro (TSI) se identificaron 27 cepas (18.49%) como fermentadoras de glucosa, lactosa y/o sacarosa (interpretación del medio = A/A [ácido sobre ácido], medio amarillo en la parte inclinada y en el fondo del tubo después de incubación), cinco de ellas (3.42%) con producción de gas (A/AG). Nueve cepas (6.16%) fueron fermentadoras de glucosa (interpretación del medio = K/A [alcalino sobre ácido], medio rojo-rosado en la parte inclinada y amarillo en el fondo del tubo después de incubación), tres de ellas (2.05%) con producción de gas (K/AG). Se identificaron 81 aislamientos (55.48%) como no fermentadores de glucosa, lactosa, ni sacarosa (interpretación del medio = K/K [alcalino sobre alcalino], medio rojo-rosado en la parte inclinada y en el fondo del tubo después de incubación [27 aislamientos; 18.49%]; K/NC [alcalino sobre sin cambios], medio rojo-rosado en la parte superior y rojo-naranja en el fondo del tubo después de incubación [20 aislamientos; 13.70%]; o NC/NC [sin cambios sobre sin cambios], medio rojo- naranja en la parte inclinada y en el fondo del tubo después de incubación [34 aislamientos; 23.29%]). No se observó producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) en ninguna de las cepas evaluadas. No se determinó el perfil de 29 cepas (19.86%) en esta prueba (Cuadro 1.3). 30 Cuadro 1.3 Caracterización morfológica, fisiológica y bioquímica de las colonias de 146 aislamientos bacterianos aislados a partir de muestras de plantas de tomate con síntomas de infecciones bacterianas colectadas en siete cantones del Valle Central de Costa Rica. La evaluación de las características se realizó después de 24-48 horas de incubación a 28°C ± 2°C. Características Asa Frecuencia Relativa (%) Morfológicas Forma circular 109 74.66 irregular 21 14.38 puntiforme 16 10.96 Bordes enteros 115 78.77 lobulados 9 6.16 ondulados 22 15.07 Elevación convexa 2 1.37 elevada 88 60.27 plana 54 36.99 umbonada 2 1.37 Consistencia lisa 137 93.84 mucoide 3 2.05 rugosa 6 4.11 Color amarillo 72 49.32 blanco 32 21.92 crema 13 8.90 naranja 18 12.33 rosado 6 4.11 incoloro 5 3.42 Apariencia frente a luz emitida opaca 104 71.23 translúcida 42 28.77 Apariencia frente a luz reflejada brillante 145 99.32 opaca 1 0.68 Tamaño grande 18 12.33 pequeña 128 87.67 Bioquímicas Tinción de Gram bacilos Gram negativos 43 29.45 cocos Gram negativos 3 2.05 bacilos Gram positivos 29 19.86 cocos Gram positivos 58 39.73 NDb 13 8.90 KOH 3% negativa 104 71.23 positiva 42 28.77 Catalasa negativa 13 8.90 positiva 133 91.10 31 Características Asa Frecuencia Relativa (%) Oxidasa negativa 116 79.45 positiva 30 20.55 Fluorescencia en medio B de King no fluorescente 91 62.33 fluorescente 21 14.38 ND 34 23.29 Fermentación de lactosa en medio MacConkey negativa 35 23.97 no crecimientoc 85 58.22 ND 26 17.81 Fermentación de glucosa, lactosa y/o sacarosa en medio TSId A/A 22 15.07 A/AG 5 3.42 K/A 6 4.11 K/AG 3 2.05 K/K 27 18.49 K/NC 20 13.70 NC/NC 34 23.29 ND 29 19.86 aAs = Número de aislamientos. bND = No determinado (aislamientos que no fueron evaluados en la prueba correspondiente). cno crecimiento = aislamientos que no crecieron en el medio de agar MacConkey. dCódigos de interpretación en medio TSI: A/A = ácido/ácido (fermentadoras de glucosa de forma aeróbica y de glucosa, lactosa y/o sacarosa). K/A = alcalino/ácido (fermentadoras de glucosa). K/K = alcalino/alcalino (no fermentadoras de glucosa, lactosa, ni sacarosa). K/NC = alcalino/sin cambios (no fermentadoras de glucosa, lactosa, ni sacarosa). NC/NC = sin cambios/sin cambios (no fermentadoras de glucosa, lactosa, ni sacarosa). G = producción de gas (oxígeno o dióxido de carbono). Además de las pruebas convencionales, se realizó un perfil bioquímico de 17 cepas Gram negativas con las tarjetas de identificación GN en el sistema VITEK® 2, que incluye 47 pruebas estándar de utilización de fuentes de carbono, actividad enzimática y resistencia (Pincus, 2006). Mediante la combinación de las pruebas convencionales y el perfil bioquímico generado en el sistema VITEK® 2 (Cuadro S1.2), se realizó un análisis de agrupamiento aglomerativo jerárquico para las 17 cepas evaluadas. No se registró ningún perfil idéntico entre las cepas; se obtuvo un rango de disimilitud de 0.5 a 32.1 entre ellas. Las cepas se 32 agruparon en cuatro “clusters” (Figura 1.1). En el primer “cluster” se agruparon nueve cepas de Pseudomonas sp. (LTM 13.1.2, LTM 13.1.3, LTM 14.2.2, LTM 14.3.1, LTM 32.2.1, LTM 40.2.3, LTM 78.1.1, LTM 78.2.1 y LTM 78.3.2) y dos cepas de Stenotrophomonas sp. (LTM 49.1.1 y LTM 78.2.3); en el segundo se agruparon dos cepas de Agrobacterium sp. (LTM 78.1.2 y LTM 78.2.2); en el tercero se agruparon dos cepas de Serratia sp. (LTM 71.3.2 y LTM 74.3.1); y en el cuarto las cepas de Cedecea sp. (LTM 72.2.1) y Pantoea sp. (LTM 78.3.1). La menor disimilitud (0.5) se registró entre las cepas LTM 32.2.1 y LTM 78.1.1 (Figura 1.1), ambas identificadas como Pseudomonas sp. La identificación de las cepas para el agrupamiento se realizó con el análisis molecular de la secuencia parcial del gen 16S ARNr, ya que el sistema VITEK® 2 logró identificar solamente 11 cepas (64.7%) exitosamente a nivel de género, e identificó de forma incorrecta o nula seis de las cepas evaluadas. Figura 1.1 Agrupamiento de las cepas bacterianas según el perfil bioquímico combinado de pruebas convencionales y el sistema VITEK® 2. Se muestra el dendrograma del agrupamiento jerárquico de las cepas en cuatro “clusters”, obtenido con el método aglomerativo de Ward a partir de una matriz distancias eucledianas para calcular la disimilitud entre las cepas evaluadas. Celdas con tonalidades azules en la matriz de distancias indican mayor similitud entre las cepas. 33 1.3.3 Análisis molecular 1.3.3.1 Detección de bacterias fitopatógenas en tejido sintomático de plantas de tomate Se utilizaron cebadores específicos en reacciones de PCR de tiempo final con muestras de tejido sintomático de tomate y se detectó la presencia del género Xanthomonas en cinco plantas de 54 evaluadas (frecuencia de detección = 9.26%), en los cantones de Paraíso y Turrialba en la provincia de Cartago, Barva y Santa Bárbara en la provincia de Heredia. La bacteria Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum fue detectada en dos plantas (3.70%), en el cantón de Turrialba en la provincia de Cartago y en el cantón Alajuela en la provincia de Alajuela (Cuadro 1.4; Figura 1.2). El género Pseudomonas se detectó en un total de 52 plantas (96.30%) en los siete cantones evaluados. Dentro de este género, se detectó la presencia de Pseudomonas mediterranea, en 15 plantas (27.78%), en el cantón Paraíso de la provincia de Cartago, Alajuela y Zarcero en la provincia de Alajuela, y Barva en la provincia de Heredia; y la presencia de Pseudomonas syringae pv. tomato en seis plantas (11.11%), en los cantones Paraíso y Turrialba en la provincia de Cartago, Barva y Santa Bárbara en la provincia de Heredia (Cuadro 1.4; Figura 1.2). Se detectó la coexistencia de Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum y Pseudomonas mediterranea en una planta del cantón de Alajuela, P. carotovorum subsp. carotovorum y Pseudomonas syringae pv. tomato en una planta del cantón Turrialba, y Pseudomonas syringae pv. tomato y Xanthomonas sp. en una planta del cantón de Santa Bárbara; además de la presencia simultánea de Xanthomonas y Pseudomonas en plantas de los cantones de Barva en Heredia, Paraíso y Turrialba en Cartago (Cuadro 1.4; Figura 1.2). No se detectó la presencia de Dickeya chrysanthemi, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Xanthomonas vesicatoria (= X. campestris pv. vesicatoria) ni Pseudomonas corrugata en las muestras analizadas. 34 Cuadro 1.4 Detección de géneros o especies de bacterias fitopatógenas objetivo mediante la amplificación de ADN con cebadores específicos a partir de muestras de tejido de plantas de tomate con síntomas de infecciones bacterianas. ID de Planta Cantón Provincia Vara Síntomas Género/Especie detectada LTM_11 Paraíso Cartago JR Peca bacteriana en hojas Pseudomonas syringae pv. tomato LTM_12 Paraíso Cartago JR Hojas cloróticas; necrosis en tallo y hojas; tallo hueco Pseudomonas sp. LTM_13 Paraíso Cartago 7810 Necrosis en tallo; tallo hueco Pseudomonas sp. LTM_14 Paraíso Cartago 7810 Lesiones necróticas en tallo; tallo hueco Pseudomonas sp. LTM_15 Paraíso Cartago Cherry grape Marchitez general Xanthomonas sp.; Pseudomonas mediterranea LTM_16 Turrialba Cartago NDb Peca bacteriana en hojas; lesión necrótica en raíz y tallo; tallo hueco Xanthomonas sp.; Pseudomonas sp. LTM_17 Turrialba Cartago ND Lesiones necróticas en hojas y tallo superior Pseudomonas sp. LTM_18 Turrialba Cartago ND Necrosis acuosa en tallo inferior; marchitez Pseudomonas syringae pv. tomato LTM_19 Turrialba Cartago ND Necrosis interna en raíz y tallo inferior; hojas marchitas y con manchas marrones Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; Pseudomonas syringae pv. tomato LTM_20 Turrialba Cartago ND Peca bacteriana en hojas – LTM_21 Turrialba Cartago ND Lesiones acuosas y hundidas en fruto Pseudomonas syringae pv. tomato LTM_22 Turrialba Cartago Vulcano Necrosis en base del tallo y tallo superior; marchitez Pseudomonas sp. LTM_23 Alvarado Cartago JR Necrosis en base del tallo; tallo hueco; marchitez Pseudomonas sp. LTM_24 Alvarado Cartago JR Necrosis en base del tallo; marchitez Pseudomonas sp. LTM_25 Alvarado Cartago JR Necrosis en raíz y base del tallo; marchitez Pseudomonas sp. LTM_28 Paraíso Cartago Armada + Milán Necrosis en tallo inferior; tallo hueco Pseudomonas sp. LTM_29 Paraíso Cartago Armada + Milán Necrosis acuosa en tallo superior; tallo hueco Pseudomonas sp. LTM_30 Alajuela Alajuela Green rise + 7810 Necrosis acuosa en tallo inferior y tallo superior; tallo hueco; marchitez Pseudomonas sp. 35 ID de Planta Cantón Provincia Vara Síntomas Género/Especie detectada LTM_32 Alajuela Alajuela Green rise + 7810 Necrosis acuosa en tallo inferior y tallo superior; tallo hueco; marchitez Pseudomonas sp. LTM_33 Alajuela Alajuela Green rise + 7810 Necrosis seca y acuosa en tallo inferior y tallo superior; tallo hueco; marchitez Pseudomonas sp. LTM_34 Zarcero Alajuela JR Marchitez general Pseudomonas sp. LTM_35 Zarcero Alajuela JR Necrosis y agrietamiento en base del tallo; tallo hueco Pseudomonas sp. LTM_36 Zarcero Alajuela JR Puntos grises con apariencia de chancros en fruto Pseudomonas sp. LTM_37 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en base del tallo; tallo hueco; marchitez Pseudomonas sp. LTM_38 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en base del tallo; tallo hueco; marchitez Pseudomonas sp. LTM_39 Alajuela Alajuela Toreto Necrosis en base del tallo; tallo hueco; marchitez Pseudomonas sp. LTM_40 Alajuela Alajuela 7810 Necrosis acuosa en raíz, base del tallo, tallo inferior y tallo superior; clorosis y marchitez Pseudomonas sp. LTM_41 Alajuela Alajuela TD1 + 7810 Necrosis en base del tallo, tallo superior y hojas; tallo hueco Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; Pseudomonas mediterranea LTM_42 Alajuela Alajuela ND Necrosis en base del tallo; marchitez NAc LTM_46 Alajuela Alajuela Green rise + 7810 Lesión agrietada en base del tallo y tallo inferior; marchitez Pseudomonas mediterranea LTM_47 Alajuela Alajuela TD1 + Toreto Necrosis acuosa en base del tallo y tallo inferior; marchitez Pseudomonas sp. LTM_48 Alajuela Alajuela TD1 + Toreto Necrosis acuosa en base del tallo y tallo inferior; marchitez Pseudomonas mediterranea LTM_49 Zarcero Alajuela JR Necrosis interna y externa en base del tallo; tallo hueco Pseudomonas sp. LTM_50 Zarcero Alajuela JR Necrosis en base del tallo, tallo inferior y tallo superior; marchitez Pseudomonas sp. LTM_51 Zarcero Alajuela JR Necrosis interna en base del tallo y tallo inferior; clorosis Pseudomonas sp. 36 ID de Planta Cantón Provincia Vara Síntomas Género/Especie detectada LTM_52 Zarcero Alajuela JR Necrosis y agrietamiento en base del tallo, tallo inferior y tallo superior; marchitez Pseudomonas sp. LTM_53 Alajuela Alajuela 7810 Pudrición acuosa en tallo inferior y tallo superior; marchitez Xanthomonas sp.; Pseudomonas mediterranea LTM_58 Barva Heredia 8565 Necrosis en base del tallo; clorosis y marchitez Pseudomonas syringae pv. tomato LTM_59 Barva Heredia 8565 Necrosis en base del tallo, tallo inferior, tallo superior y hojas; clorosis y marchitez Pseudomonas sp. LTM_60 Barva Heredia 8565 Necrosis en base del tallo, tallo inferior y tallo superior; marchitez – LTM_61 Barva Heredia