1 UNIVERSIDAD DE COSTA RICA CIUDAD UNIVERSITARIA RODRIGO FACIO BRENES LICENCIATURA EN ODONTOLOGÍA Evaluación de la liberación de iones Ca2+, pH y resistencia a la flexión de cuatro cementos selladores endodónticos bioactivos TRABAJO FINAL DE GRADUACIÓN PARA OPTAR POR EL GRADO DE LICENCIATURA EN ODONTOLOGÍA Presentado y defendido por Luis Carlos Suárez Quesada B77605 Fiorella Infante Amore B73864 Eladio Ramírez Hidalgo B45628 Comité Asesor Marianella Benavides García (Directora) Jorge Soto Montero (Asesor) Alejandra Brenes Alvarado (Asesora) San José, Costa Rica, diciembre de 2023 2 3 DEDICATORIA A Dios, por cada palabra que me regaló en estos años. A mis padres y hermanos, por todo su amor y apoyo incondicional, sin ellos no podría haber culminado esta etapa. A mi Nonno, que desde hace 8 años no está conmigo, pero siempre he guardado en mi corazón todos sus consejos y enseñanzas. A mi amada Nonna, que siempre soñó con estar en todos mis momentos importantes y 11 días antes de esta presentación ha partido al cielo, pero sé que desde ahí me acompaña. A mi comunidad del Camino Neocatecumenal, por sus oraciones. A mis compañeros y amigos, Valeria Martínez, Valeria Hidalgo, Luis Suárez y Susana Castro, por haber compartido conmigo tantas risas, lágrimas y horas de estudio. A Fernando, mi novio, por haberme acompañado en la recta final de esta etapa. Fiorella A mi mamá, mi papá y mi hermano, por haber sido un apoyo incondicional durante toda mi carrera, acompañándome en el proceso que tomó construir mis sueños, fueron un pilar que me permitió llevar a cabo los sacrificios necesarios durante estos años. Tengo la certeza de que existían personas que creían en mí para lograr mis cometidas, estas me ayudaron a nunca dudarlo. A mi abuela, Ani y madrina, Tatiana, por estar presentes siempre. A mis amigas Valeria Hidalgo, Fiorella Infante, Valeria Martínez, Sofía Barquero, por haberme permitido encontrar una familia en la universidad. A mi novio, Alexander Araya, por darme una estabilidad que no sabía que necesitaba en mi último año. Finalmente, quiero dedicarle este trabajo al Luis de 17 años, que en el 2016 se dio cuenta de que fue admitido en 4 Odontología mientras esperaba un bus, y aunque no tenía idea de lo que venía, estaba impaciente por empezar un camino que hoy concluyo. Luis Este trabajo es la culminación de tantos años de dedicación y entrega en los cuales fueron invertidos horas, días, meses, fines de semanas y sacrificios, en los que hoy veo reflejado todo el esfuerzo a lo largo de todos estos años. Por eso es que te lo dedico a ti madre, por brindarme el apoyo desde el día en el que tuve el sueño que hoy se cumple, por todo el amor incondicional, y lo más importante, por ser mi pilar de vida en todos estos años. A Ezequiel, mi mejor amigo y hermano que me ha brindado su apoyo sin cuestionar o dudar en todo momento y por último a Kathe, Vale y Johnny, que de una u otra forma hicieron más ameno este largo camino. Eladio 5 HOJA DE REVISIÓN POR LA FILÓLOGA 6 ÍNDICE RESUMEN EN ESPAÑOL ................................................................................................................ 7 ABSTRACT ........................................................................................................................................ 8 PARTE I: ANTECEDENTES/MARCO TEÓRICO/MARCO CONCEPTUAL ........................... 9 Capítulo I: Cementos Bioactivos Endodónticos y su aplicación en la clínica. .............................. 12 Capítulo II: Resistencia a la flexión en Biomateriales dentales. .................................................... 16 Capítulo III: Liberación de iones interacción con la dentina, bioactividad y pH. ....................... 18 PARTE II: MARCO METODOLÓGICO ...................................................................................... 22 Objetivos ............................................................................................................................................ 23 Objetivo general. ............................................................................................................................... 23 Objetivos específicos. ........................................................................................................................ 23 Hipótesis ............................................................................................................................................ 24 Unidades estadísticas ........................................................................................................................ 24 Metodología ....................................................................................................................................... 25 Medición de liberación de ion calcio (Ca2+) y pH ........................................................................... 25 Medición de la resistencia a la flexión ............................................................................................. 28 Definición de variables ..................................................................................................................... 30 Determinación de cantidad de muestras ......................................................................................... 30 Consideraciones éticas ...................................................................................................................... 31 Financiamiento .................................................................................................................................. 31 PARTE III: RESULTADOS ............................................................................................................ 33 Resultados: Resistencia a la flexión y Módulo de flexión ............................................................... 34 Resultados: Liberación de Iones de Ca2+ ......................................................................................... 34 Resultados: Cambio de pH en el medio de las muestras ................................................................ 36 PARTE IV: DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES ............................................................................. 39 Conclusiones ...................................................................................................................................... 50 REFERENCIAS ................................................................................................................................ 51 APÉNDICES ..................................................................................................................................... 61 ANEXOS ........................................................................................................................................... 65 7 RESUMEN EN ESPAÑOL El objetivo de este estudio fue evaluar la liberación de iones de calcio, la resistencia a la flexión y el pH de los cementos endodónticos bioactivos ProRoot MTA Ⓡ, BIODENTINE Ⓡ y Bio C Repair Ⓡ y NeoPutty Ⓡ. Para evaluar la liberación de calcio se utilizaron 34 discos de 2 mm de dentina radicular estandarizados en el conducto con Gates Glidden número 6, obturados y sumergidos en una solución de 10 ml de PBS, se realizaron mediciones con pHímetro y espectrometría atómica al día 1, 3 5, 10 y 15. En cuanto a la prueba de resistencia a la flexión, se confeccionaron moldes de 10 barras de 7 mm x 2 mm x 2 mm de cada material, almacenados en recipientes herméticos con humedad durante 48 horas, estos especímenes se sometieron a la prueba mini-flex. Resultados: Los discos de dentina obturados con el Biodentine obtuvieron una menor liberación de calcio y presentaron una diferencia estadísticamente significativa (p=< 0.01) con respecto a los otros cementos; en la prueba de resistencia a la flexión el ProRoot MTA, se presentó mayor fuerza flexural; sin embargo, no hubo diferencia estadísticamente significativa (p=>0.05) entre los cementos. Se concluye que el NeoPutty es el material con mayor liberación de iones de calcio a lo largo de los 15 días y ProRoot MTA obtuvo mayor resistencia a la flexión. Palabras claves: Biodentine; calcium silicate; MTA; pH; calcium ion release. 8 ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the calcium ion release, flexural strength and pH of the bioactive endodontic cements ProRoot MTA Ⓡ, BIODENTINE Ⓡ and Bio C Repair Ⓡ and NeoPutty Ⓡ. To evaluate calcium release, 34 2 mm discs of standardized root dentin were used in the canal with Gates Glidden number 6, filled and immersed in a 10 ml PBS solution. Measurements were carried out with a pH meter and atomic spectrometry on day 1. 3 5, 10 and 15. Regarding the flexural strength test, molds were made of 10 bars of 7 mm x 2 mm x 2 mm of each material, stored in airtight containers with humidity for 48 hours, these specimens were subjected to the mini-flex test. Results: The dentin discs filled with Biodentine obtained a lower calcium release, presenting a statistically significant difference (p=< 0.01) with respect to the other cements; In the flexural strength test, the ProRoot MTA presented greater flexural strength; however, there was no statistically significant difference (p=>0.05) between the cements. It is concluded that NeoPutty is the material with the highest release of calcium ions over the 15 days and ProRoot MTA obtained the highest flexural resistance. Keywords: biodentine: calcium silicate; MTA; pH; calcium ion release. 9 PARTE I: ANTECEDENTES/MARCO TEÓRICO/MARCO CONCEPTUAL 10 Introducción Cuando se trata de materiales dentales, es necesario considerar ciertas propiedades o cualidades que estos deben cumplir para considerarse un material de elección en la odontología moderna, entre ellas su biocompatibilidad, la cual se establece como aquel material que una vez introducido en el cuerpo humano evoca una nula o mínima interacción en los tejidos con los que entra en contacto; asimismo, es deseable la bioactividad, siendo esta aquella propiedad que promueve una regeneración en los tejidos suaves o duros del cuerpo humano (1); en otras palabras, es aquella propiedad que induce a una respuesta positiva, mediante diferentes mecanismos en los tejidos del ser humano. Los biomateriales orales pueden ser sintéticos o naturales y son capaces de reemplazar partes de un sistema vivo o ejercer una función cuando se encuentran en contacto con los tejidos vivos (2). Asimismo, los materiales que se utilizan en odontología poseen propiedades físicas, las cuales corresponden a un parámetro medible de la transformación de un sistema al ser sometido a un medio, por lo tanto, estas propiedades de los biomateriales pueden condicionar su rendimiento (3). Actualmente, se utilizan materiales bioactivos hidráulicos que proveen soluciones clínicas como el reemplazo de dentina, recubrimientos pulpares, pulpotomías, creación de barreras apicales en dientes con ápices abiertos, reparación de perforaciones radiculares y defectos de reabsorción, así como obturaciones ortógradas o retrógradas del conducto radicular (4). Al considerar la aplicación clínica de los cementos hidráulicos, resulta pertinente considerar la relevancia que tiene el estudio de propiedades biomecánicas como la resistencia a la flexión, el cambio de pH en el medio y la capacidad de liberación de iones calcio, esta 11 última como propiedad bioactiva, estas son características que se deben estudiar considerando las nuevas presentaciones de cementos endodónticos bioactivos y la gran diversidad que existe entre ellos. La liberación de iones calcio permite medir el potencial remineralizante de los cementos endodónticos bioactivos (5), y a la vez que se dé un depósito de apatita con potencial odontoblástico (6). Por otra parte, otra característica deseable en un material dental es su resistencia a la flexión, es decir, la fuerza por unidad de área en el instante de su fractura al ser sometido a una carga de flexión (4). Lo ideal es que el material tenga una resistencia similar al tejido dentario (7). Esta investigación busca evaluar la resistencia a la flexión, la liberación de iones calcio y el cambio de pH en un medio específico de cuatro cementos endodónticos con propiedades bioactivas como lo son el ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply, el Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y el más reciente producto NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. 12 Capítulo I: Cementos Bioactivos Endodónticos y su aplicación en la clínica. Durante las últimas tres décadas, se ha estudiado el desarrollo de materiales dentales bioactivos que puedan interactuar e inducir la regeneración del tejido circundante, siendo bioactivos, biocompatibles y con propiedades antimicrobianas alcalinizantes (8). El primer cemento endodóntico bioactivo que ha sido altamente estudiado y que se cataloga como el “Gold Standard” es el Mineral Trióxido Agregado (MTA), este fue creado como un sustituto superior al hidróxido de calcio en aplicaciones clínicas (9). El MTA es uno de los materiales bioactivos más utilizados en odontología, fue introducido en 1993 por Torabinejad. Este material fue patentado y comercializado a partir de 1995. En endodoncia se empezó a utilizar a partir de 1998 (7). En sus inicios este producto era de color gris, pero debido a la decoloración reportada de las piezas dentales a partir del 2002 se cambió la composición eliminando el hierro y de esta forma el MTA de color blanco sale al mercado, igual generando decoloración en los dientes, pero en menor medida que el primero (9). En la actualidad, los resultados de las revisiones sistemáticas demuestran que el MTA tiene un rendimiento superior al hidróxido de calcio como recubrimiento pulpar directo, el hidróxido de calcio como material endodóntico posee limitaciones considerables, como lo son la presencia de túneles en el puente de la dentina, la obliteración de la cámara pulpar, la alta solubilidad, la mala capacidad de sellado y degradación con el tiempo, no obstante, estudios de mayor magnitud, ciegos y aleatorizados indican que es necesario realizar ensayos controlados para proporcionar evidencia clínica más confiable (9) (10). Los cementos bioactivos son utilizados en la práctica clínica, principalmente en la rama de endodoncia, se pueden utilizar para recubrimiento pulpar directo, pulpotomía, apexificaciones, obturación endodóntica de conductos radiculares, tratamientos de fracturas 13 radiculares horizontales, reabsorciones radiculares externas e internas y reparación de perforaciones. A nivel de otras disciplinas se utiliza como base en la remoción de caries profundas (11), incluso se han constituido como una opción de obturación coronal temporal para regeneración de tejido (12). El ProRoot MTA al haber salido al mercado hace más de dos décadas ha tenido muchos estudios donde se ha demostrado su biocompatibilidad. Este cemento se encuentra mayormente constituido por silicato tricálcico, silicato dicálcico y aluminato tricálcico que al ser mezclados con agua se produce hidrato de silicato de calcio e hidróxido de calcio (9) y óxido de bismuto como radioopacificador (13) con un valor de 7.17 mm del equivalente al grosor del aluminio (14). El MTA tiene indicaciones de uso endodóntico y restaurativo (15). La bioactividad del MTA es resultado inicialmente de la liberación de iones de calcio que interactúan con fosfatos, induciendo la formación de hidroxiapatita, además posee un efecto directo sobre la regeneración de la pulpa dental y secreción TFG-Beta 1, este factor señala la migración de las células odontoblásticas que secretan dentina reparadora. El mineral trióxido agregado es menos tóxico y produce menor inflamación en las células pulpares que el hidróxido de calcio (9). Desde el 2010 se comercializan nuevos cementos basados en silicato tricálcico premezclado (16), que abren una gama nueva de posibilidades y materiales aplicables en la clínica, entre estos nuevos biomateriales, uno de los más recientes es el NeoMTA que ha salido al mercado como NeoPutty, este producto corresponde a una nueva presentación de MTA premezclada en una consistencia putty, que se compone de óxido de tantalio como radioopacador, silicato tricálcico, silicato dicálcico, aluminato tricálcico y sulfato de calcio 14 (17). Tiene la ventaja de que su consistencia permite una mejor manipulación, además, estudios in vitro indican que es citocompatible y posee bioactividad (16), además se observó que indujo la formación de “nódulos mineralizados”, incluso más que el MTA de uso convencional (13). Una de sus desventajas es que la consistencia de putty de estos cementos hidráulicos tiene una vida útil corta después de ser abierto, debido a que al exponerse a la humedad del ambiente causa un endurecimiento prematuro del producto (16). Por otra parte, el Biodentine corresponde a otro cemento basado en silicato tricálcico que es bioactivo, al compararlo con el “gold standard”, MTA respecto a su odontogénesis, angiogénesis, osteogénesis y citotoxicidad, se encuentra que tienen características similares (18). Su composición corresponde a silicato tricálcico, silicato dicálcico, carbonato cálcico, óxido de zirconio, óxido de calcio, óxido de hierro, con un tiempo de fraguado de de 6,5 – 45 minutos (19). En su presentación, el líquido corresponde a una solución acuosa con cloruro de calcio con una mezcla de policarboxilato modificado. El polvo se mezcla con el líquido en un amalgamador durante 30 segundos y una vez mezclado, se endurece en unos 12-16 min (12), el Biodentine se introdujo en el mercado dental en 2009 como un “sustituto de la dentina”, que facilita su penetración en los túbulos dentinarios abiertos (14)(8). Basandose en la casuística reportada se puede mencionar que se le da uso no sólo como material de reparación endodóntico, sino también como material de restauración coronal para dentina de reemplazo (12). Respecto a su composición, existen estudios que cuestionan que realmente exista silicato dicálcico en su composición (20). La radiopacidad de Biodentine fue significativamente menor que la de otros cementos a base de silicato tricálcico. 15 Por otra parte, este material exhibió resistencia a la compresión, microdureza, resistencia a la flexión, capacidad de sellado, fuerza de unión por expulsión y liberación de iones de calcio significativamente superiores en comparación con otros cementos a base de silicato tricálcico, se infiere que la mayor resistencia mecánica y la solidificación más rápida se da debido a que no contiene aluminato de calcio ni sulfato de calcio (20), como en el caso del MTA si cuenta con el mismo (16). El Bio C Repair es un cemento endodóntico al que se cambió la presentación típica (polvo-líquido), a una jeringa con el material listo para dispensar. Esta nueva formulación incluye silicato de calcio, óxido de calcio, óxido de zirconio, óxido de hierro, dióxido de silicio y un agente dispersante (21). Este biomaterial muestra una composición del 34.81% de carbón y un 34.51% de oxígeno con una concentración baja de calcio comparada con el ProRoot MTA y el Biodentine (22). Cabe resaltar que este cemento bioactivo mostró tener una cantidad similar de óxido de zirconio en el Biodentine como radioopacador, comparada con el ProRoot MTA ya que este último, utiliza óxido de bismuto (22). Respecto a la citotoxicidad de Bio C Repair, se ha demostrado que este cemento no es citotóxico para estas células (22). En Benetti et al, 2019 se logró demostrar que este material tiene una citocompatibilidad similar a la del MTA Angelus (21). Reconociendo la bioactividad de cada cemento, se sugiere dentro de la literatura referirse a estos como “cementos endodónticos bioactivos” a razón de que su composición puede variar, pero todos cuentan con bioactividad. Asimismo, es un hecho que, de los cementos endodónticos bioactivos, el MTA cuenta con la mayoría de los estudios en el ámbito (19). 16 Por otra parte, se debe considerar las nuevas composiciones alternas que han surgido de los nuevos cementos endodónticos bioactivos en fases sol gel, que tienen dentro de sus propiedades una rápida liberación de iones terapéuticos y alta capacidad de carga de fármaco, lo que potencia su aplicación en terapia de regeneración del complejo dentino-pulpar (23). Se ha pasado de cementos polvo líquido a contar con presentaciones premezcladas dispensables en jeringa, y se han demostraron respuestas biológicas satisfactorias y un potencial comparable con ProRoot MTA en su presentación de polvo y líquido (24). Por otra parte, en Peñareta et al 2020 se señala que el polvo líquido cuenta con capacidad de liberación de iones y alcalinización mayor que la de presentaciones premezcladas (25). Respecto a la presentación del material, se indica una diferenciación del empleo. Los cementos endodónticos bioactivos premezclados están disponibles en dos formas: una pasta de menor viscosidad para sellado endodóntico y una versión de putty de mayor viscosidad para contacto pulpar directo y otros procedimientos de restauración endodóntica (16). Capítulo II: Resistencia a la flexión en Biomateriales dentales. Dentro de las propiedades que poseen los materiales dentales, se debe considerar la relevancia de las mecánicas que deben tener para cada tratamiento. Una de las propiedades mecánicas más importantes en los materiales dentales es la resistencia a la flexión, por cuanto las piezas dentales están sometidas a fuerzas de forma constante, esta propiedad no está aislada, sino que se encuentra íntimamente relacionada a la resistencia a la compresión (25). Los estudios sobre los materiales dentales consideran la necesidad de resistencia a fuerzas tanto fisiológicas como patológicas mecánicas, y la necesidad de reproducir condiciones parecidas a las que se presentan intraoralmente (26). 17 En los cementos bioactivos a base de silicatos de calcio se debe considerar dentro de sus más grandes desventajas, las bajas propiedades mecánicas, debido a los componentes como el aluminato, los cuales generan fragilidad en estos materiales (25). La resistencia de los cementos biocerámicos es menor con respecto a otros tipos de cementos, pero esta propiedad aumenta con el paso del tiempo. Existen estudios que confirman esto, pues al estar sometidos a una constante hidratación, ocurre una cristalización de la superficie del material con el pasar de los días (27). Esto puede explicar lo indicado por el fabricante del Biodentine, quién refiere que este material puede tener una fuerza a la compresión de 100 MPA la primera hora posterior a su fraguado e incluso luego de un mes, puede llegar a 300 MPa, valor muy similar a la resistencia a la compresión de la dentina natural la cual corresponde a 297 MPa (28). Estudios previos han demostrado que una obturación completa de los conductos radiculares con materiales a base de silicato de calcio puede ser ventajosa en cuanto al comportamiento biomecánico de la pieza dental (29); no obstante, en estudios in vitro, no se han encontrado diferencias significativas a la fractura de dientes obturados de materiales biocerámicos y dientes sin obturar (30). A partir de diversas metodologías in vitro se han determinado valores de propiedades biomecánicas para cementos endodónticos bioactivos, los cuales siguen una línea de evaluación propia del material; por ejemplo, para el Biodentine según la información suministrada por el fabricante su resistencia a la flexión corresponde a 34 MPa, también indica que la mayor resistencia del biodentine se debe a la utilización del polímero hidrosoluble; este permite reducir la relación agua/cemento utilizada en su preparación (28). Asimismo, el MTA, cuenta con una resistencia a la flexión reportada de 14,27 MPa (14); sin 18 embargo, las metodologías usadas para cada material no coinciden. Además, existe una diversidad de metodologías para medir la resistencia a la flexión en diferentes momentos de su fraguado. Por otra parte, los estudios reconocen la existencia de una necesidad de caracterizar las propiedades de los nuevos cementos bioactivos endodónticos, pues se cuenta con muchos estudios de MTA; sin embargo, no ha sido de la misma manera para las nuevas formulaciones y marcas comerciales a través de los años (8). En cuanto a la resistencia a la compresión del Bio C Repair y del NeoPutty el fabricante no indica cuál es el valor de esta propiedad física y no se encontraron estudios, artículos o tesis donde se haya evaluado o se indique un valor de referencia. Capítulo III: Liberación de iones interacción con la dentina, bioactividad y pH. Se entiende la bioactividad de los cementos endodónticos como un proceso que incluye la diferenciación de células, las cuales permiten la regeneración del tejido por medio de células madre mesenquimales y células madre de la pulpa dental (31). Además, los cementos endodónticos bioactivos de fosfato de calcio conforman materiales que logran generar esta cualidad en células madre mesenquimales (32). Se debe comprender que al implantar un biomaterial en el organismo las primeras células que responden al estímulo, se conforman de macrófagos, por ello biomateriales basados en fosfato de calcio terminan siendo además de bioactivos, osteinmunomoduladores, esta cualidad es otorgada por el cambio de pH generado en el medio (33). De acuerdo a lo anterior, se determina que las cerámicas de fosfato de calcio bifásico pueden promover la polarización mediada por receptor sensor de calcio (CaSR) de los macrófagos M2 para la inducción, ósea mediante la liberación continua de iones de calcio (8). 19 Por otra parte, el efecto de aumento del pH por la liberación de iones hidroxilo sobre la actividad enzimática bacteriana tiene repercusiones en su crecimiento, metabolismo, y división celular, lo cual desencadena efectos nocivos por medio de agresiones químicas al componente orgánico en la integridad de la membrana citoplasmática (34); por esto el cambio de pH en el medio es un factor de suma importancia en los cementos endodónticos, porque gracias a su alta alcalinidad le confiere su propiedad bactericida. Esto regula la actividad catalítica de algunas enzimas, influye en la velocidad de reacción y provoca una modificación en su medio externo que puede afectar en la actividad celular de las bacterias (35). Varios estudios han investigado la biocompatibilidad y bioactividad de las biocerámicas en endodoncia, el MTA es el material más investigado; sin embargo, no existen suficientes estudios para evaluar otras biocerámicas en comparación con el MTA y existen diferencias en los métodos y resultados de varios modelos in vitro. Por lo tanto, se necesitan estudios más completos que proporcionen evidencia de alto nivel sobre la aplicación de estos materiales en tratamientos de endodoncia (8). De acuerdo con la evidencia científica a través del tiempo, el mineral trióxido agregado (MTA) cuenta con la capacidad de liberar iones hidroxilo (OH-) e iones de calcio (Ca2+). En un estudio realizado con diferentes tipos de MTA con cilindros de este material, se observó un pico de pH de 10 en sus primeras 24 horas; en los días posteriores, mostró un comportamiento con reducción y aumentos de pH, que, según los autores, puede deberse a la formación de portlandita (Ca (OH)2) la cual libera al medio iones OH- y Ca2+, sobresaturado el medio (35). En un principio, el componente dicálcico y tricálcico del material se hidrata y tiene como producto la formación de silicato de hidrato de calcio e hidróxido de calcio (34), o 20 Porlandita (Ca (OH)2) (35). Se da una disociación iónica de este último producto intermedio en iones calcio e hidroxilos; estos últimos son capaces de producir desnaturalización de proteínas, debido a que producen un aumento de pH, y activan la fosfatasa alcalina, esta es una enzima que estimula la liberación de fosfato inorgánico, separa los ésteres fosfóricos y, por lo tanto, libera iones fosfatos. Existen dos mecanismos que ocurren paralelamente para este punto, los iones calcio reaccionan con los fosfatos libres, forman fosfato de calcio, que es el principal componente de la hidroxiapatita y genera así, una matriz inicial óptima para la mineralización. Por otra parte, los iones calcio reaccionan con el dióxido de carbono circundante y forman carbonato de calcio (34). Las reacciones de los tejidos, que se producen por los cementos con silicato de calcio empiezan antes que el material fragüe y sigue hasta que se completa la reparación del tejido. Estas reacciones se deben a la hidratación de silicato di y tricálcico, producen la cristalización de los hidratos que determinan la resistencia del material. A partir de esta hidratación, se da una liberación continua de iones calcio e hidroxilo, lo cual genera un ambiente ideal para la mineralización de los tejidos (34). Para medir la liberación de calcio, se puede utilizar el equipo de espectroscopia de absorbancia atómica; este consiste en observar cuánto de un elemento químico determinado está presente en una solución. En un equipo de absorción atómica, la muestra es aspirada por un tubo estrecho hacia el nebulizador y se atomiza por una llama. Existen tipos de gases como aire/acetileno, los cuales permiten atomizar elementos a 2300°C, mientras que la otra mezcla de óxido nitroso/acetileno es útil para atomizar elementos que necesitan mayor temperatura, alrededor de 2900°C. Una vez que la muestra está atomizada, se ilumina con una lámpara de cátodo hueco, esta posee un cilindro de vidrio hueco sellado con un gas de 21 neón o argón, la luz de esta lámpara es absorbida por la muestra y la energía que atraviesa el elemento llega a un detector (36). Los electrones de los átomos absorben la luz a una determinada longitud de onda para ser llevados a orbitales más altos, en donde se pasa a un estado excitado de los electrones en un periodo muy breve (36). Por lo demás, la energía que llega al detector son datos conocidos, por ello la señal detectada es proporcional a la concentración del elemento medido (36). 22 PARTE II: MARCO METODOLÓGICO 23 Objetivos Objetivo general. • Evaluar la resistencia a la flexión, la liberación de iones calcio, y cambio de pH en el medio de cuatro cementos endodónticos bioactivos ProRoot MTA de Dentsply, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. Objetivos específicos. 1. Determinar la resistencia a la flexión de los cementos endodónticos bioactivos; ProRoot MTA de Dentsply, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. 2. Analizar la capacidad de liberación del ion calcio de cuatro cementos endodónticos bioactivos; ProRoot MTA de Dentsply, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon, mediante espectroscopía de absorbancia atómica a través del tiempo durante 15 días. 3. Registrar el cambio de pH del medio de cementos endodónticos bioactivos; ProRoot MTA de Dentsply, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon y las diferencias entre cementos. 4. Establecer el posible grado de correlación entre la liberación de iones calcio y cambio de pH en el medio para cada cemento bioactivo endodóntico; ProRoot MTA de Dentsply, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. 24 Hipótesis 1. No existe diferencia significativa en la resistencia a la flexión de ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. 2. No existe diferencia significativa en la liberación de iones de calcio (Ca+2) de ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. 3. No existe diferencia significativa en el cambio de pH entre ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed. 4. No existe una correlación directa y fuerte entre la liberación de iones de calcio y cambio de pH en el medio para cada cemento bioactivo ; ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona, Biodentine Ⓡ Septodont, Bio C Repair Ⓡ de Angelus y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. Unidades estadísticas Las unidades estadísticas corresponden a discos de dentina con un grosor de 2 mm (±0,5 mm) extraídos de conductos radiculares de piezas unirradiculares en cortes transversales del tercio medio radicular, obturados con cada material: • 4 discos de dentina obturados con ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona sumergidos en 10 ml (±0.5) de PBS. 25 • 10 discos de dentina obturados con Biodentine Ⓡ Septodont sumergidos en 10 ml (±0.5) de PBS. • 10 discos de dentina obturados con Bio C Repair Ⓡ de Angelus sumergidos en 10 ml (±0.5) de PBS. • 10 discos de dentina obturados con NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon sumergidos en 10 ml (±0.5) de PBS. • 3 frascos de control negativo con 10 ml con PBS. Metodología Medición de liberación de ion calcio (Ca2+) y pH • Equipo y materiales • Frascos de polietileno de 15 ml con tapa. • Solución buffer fosfato salino libre de calcio y magnesio (PBS); cloruro de sodio (NaCl) 8,01g/L, cloruro de potasio (KCl) 0,20 g/L, hidrogeno fosfato de sodio (Na2HPO4) y agua (H2O) 1,78 g/L, y fosfato monopotásico (KH2PO4) 0,27 g/L. • Espectroscopio de absorción atómica Perkin Elmer, modelo: AAnalyst 300. • pHímetro OAKTON, modelo: pH/CON 510 Series. • Cortadora de precisión con irrigación Buehler, Isomet 1000. • 34 discos de dentina de 2 ±0.5 mm de grosor de raíces de dientes unirradiculares. Ver figura 2.A. • Portaobjetos. • Espátula de endodoncia metálica estériles. • Losetas estériles. • Instrumento para plástico (IPP) estériles. 26 • Cementos bioactivos; ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona, Bio C Repair Ⓡ de Angelus, Biodentine Ⓡ Septodont y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. Espacio físico: • Centro de Investigación en Electroquímica y Energía Química (CELEQ). • Laboratorio de Biomateriales Orales de de la Facultad de Odontología de la Universidad de Costa Rica (LIMD) • Clínica de Endodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad de Costa Rica. Preparación de la muestra: Se utilizaron piezas dentales unirradiculares, las cuales se limpiaron manualmente para remover tejidos suaves y debris; de cada pieza dental, se cortaron 3 discos del tercio medio radicular, en total se cortaron 34 discos de dentina radicular estandarizados de 2 mm (± 0.5 mm) de altura con una cortadora de precisión con irrigación Buehler, Isomet 1000; asimismo, el diámetro del conducto se estandarizó por medio de su preparación con una broca rotatoria Gates Glidden N°6. Posteriormente, se le realizó un tratamiento a los discos de dentina, sumergiéndoseles 3 minutos en EDTA al 17% y 1 minuto en agua destilada. Se separaron los discos de dentina por grupo y se obturaron con los cementos a estudiar en losetas y espátulas metálicas de endodoncia estériles; el grupo 1 fue el ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona (control positivo) con 4 discos obturados, del grupo 2 con PBS sin muestra (Control negativo), 3 contenedores de polietileno con PBS, el grupo 3 Bio C Repair Ⓡ de Angelus 10 discos obturados, el grupo 4 de NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon, 10 discos obturados y el grupo 5 de Biodentine Ⓡ Septodont, 10 discos obturados. Ver figura 2. 27 Además, se colocaron los materiales en contenedores de polietileno de 15 ml y se sumergieron en solución de 10 ml de buffer fosfato salino libre de calcio y magnesio (PBS), medido con probeta y a una temperatura de 37°C y al 100% de humedad durante 15 días (5). Se tomaron 5 mediciones durante este tiempo, al día 1, 3, 5, 10 y a los 15 días con el pHímetro y el espectroscopio de absorción atómica; se realizaron recambios de la solución entre cada día de medición. Ver figura 3. • Procedimiento: Se recolectó la solución mediante decantamiento en tubos de sedimentación plásticos y se midió la liberación de iones de calcio, mediante absorción atómica y con un pHímetro se registra el pH del día correspondiente (5). • Cálculos y expresión de resultados: Se registraron los resultados por el espectroscopio de absorción atómica en mg/L y el pHímetro, además se realizó un análisis estadístico para la liberación de calcio con R versión 4.3.2, el día de colecta 1 y 5 para valorar la diferencia significativa a través del tiempo. Asimismo, se aplicó una prueba de correlación de Pearson para los datos de las variables de pH y liberación de iones de calcio. • Se utilizó el siguiente modelo estadístico para estimar las diferencias de liberación de iones calcio entre los cementos endodónticos bioactivos de interés: Yijk,D = β0 + αk + β1D+ α* k D+ β0j + β1j D+ εijk Donde: β1 es la pendiente general del día, αk es el efecto asociado al k-ésimo cemento, α* k es el efecto asociado a la interacción entre el k-ésimo cemento y el día, β0j es el efecto del j- ésimo disco de dentina sobre el intercepto, β1j es el efecto del j-ésimo disco de dentina sobre la pendiente del día. Además (β0j, β1j) ~ N2 (μ2, Σ2), donde μ2 = (0,0)T y Σ2 = (σ2 0, ρσ0σ1, ρσ0σ1, σ 2 1) 28 • Se utilizó el siguiente modelo estadístico para estimar las diferencias de medición de pH entre cementos endodónticos bioactivos de interés: Yijkl,,D = β0 + αk+ δj+(αδ)ij+ τi+ εijkl Donde: αk es el efecto asociado al k-ésimo cemento, δ es el efecto aleatorio asociado al j- ésimo día, τ es el efecto aleatorio asociado al i-esimo diente. Además, δ~N(0, σδ 2) y τ ~N(0, σ τ 2) Medición de la resistencia a la flexión Equipos y materiales • Moldes fabricados en positivo por impresión 3D (Asiga Max Uv) en resina (KeyPrint Model), en positivo con unas dimensiones de 7 mm de longitud x 2 mm altura x 2 mm de ancho. • Portaobjetos. • Espátula de endodoncia metálica estériles. • Losetas estériles. • Instrumento para plástico (IPP) estériles. • Silicona de adición consistencia pesada PUTTY. • Cementos bioactivos, ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona, Bio C Repair Ⓡ de Angelus, Biodentine Ⓡ Septodont y NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon. • Máquina de prueba máquina de ensayo universal electrodinámica (Instron E3000). Espacio físico: • Centro de Investigación en Electroquímica y Energía Química (CELEQ). 29 • Laboratorio de Biomateriales Orales de la Facultad de Odontología de la Universidad de Costa Rica (LIMD) • Clínica de Endodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad de Costa Rica. • Preparación de la muestra: se imprimió en 3D un molde para barras en positivo con el set de impresión 3D (Asiga Max Uv) en resina (KeyPrint Model), con unas dimensiones de 7 mm de longitud x 2 mm altura x 2 mm de ancho, se prepararon 10 barras de cada material a estudiar en el molde de putty, de un grosor de 7 mm de longitud x 2 mm de altura x ancho de 2 mm aproximadamente (37); se dejaron fraguar durante 48 horas en condiciones de humedad absoluta (37), dichas muestras fueron retiradas transcurridas las 48 horas para ser sometidas a la prueba de flexión. Ver figura 4 • Procedimiento: La prueba de resistencia a la flexión se realizó con una máquina de prueba de ensayo universal electrodinámica (Instron E3000) a una velocidad de cruceta de 0Æ75 mm mín.) hasta que los especímenes se fracturaron. Los accesorios de prueba fueron diseñados específicamente para permitir el centrado de la carga (38). Ver figura 5. • Cálculos y expresión de resultados: Se calculó la resistencia a la flexión en megapascales, siguiendo la siguiente ecuación 𝜎 = 3𝐹𝐿 2𝑏ℎ2 Donde: F: es la fuerza máxima en Newtons, ejercida sobre el espécimen. L: es la distancia, en milímetros entre los soportes, precisa a 0,01 mm. 30 b: es el grosor, en milímetros en el centro de la muestra medida antes del ensayo. h: es la altura, en milímetros, al centro de la muestra medida antes del ensayo (38). • Unidades estadísticas para esta prueba: 10 especímenes por material. • Presentación de resultados: Se analizaron las diferencias estadísticas según lo establecido en la tabla 5, con el programa IBMⓇ StatisticsⓇ versión 23. Definición de variables Prueba 1: Liberación de Calcio Dependiente: Concentración de ion Ca2+ liberado. Independiente: Cemento bioactivo. Prueba 2: pH. Dependiente: Cambio de pH en el medio de las muestras. Independiente: Cemento bioactivo. Prueba 3: Resistencia flexural Dependiente: Resistencia a la flexión. Independiente: Cemento bioactivo. Determinación de cantidad de muestras En ambas pruebas se determinó por conveniencia utilización de 10 muestras por cemento evaluado, a excepción del MTA en la liberación de iones de calcio (que fueron 4 muestras), porque este material, al ser el que cuenta con mayor cantidad de estudios a través del tiempo, se utilizó como control positivo en dicha prueba. Cabe destacar que debido al alto 31 costo del estudio y basado en estudios previos (5)(6), se determinó qué cantidad de muestras por cemento a evaluar serían 10 (n=10). Para la prueba de resistencia a la flexión se utilizaron 10 especímenes (barras) por material (Bio C Repair Ⓡ de Angelus, MTA, NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon y Biodentine Ⓡ Septodont), basados en la variación de la ISO 4049 (Miniflex) utilizada por Yap et al. (37) para creación de las muestras. Además, se utilizaron 10 especímenes tomando en cuenta cálculos estadísticos de muestra que realizaron investigaciones con el mismo modelo experimental (41). Se utilizaron 4 muestras de discos de dentina obturados con ProRoot MTA Ⓡ de Dentsply Sirona (grupo control positivo) y 10 muestras de discos de dentina por grupo de cada material a estudiar (Bio C Repair Ⓡ de Angelus, NeoPutty Ⓡ de BioMed Avalon y Biodentine Ⓡ Septodont) para la prueba de liberación de calcio. Consideraciones éticas Se solicitó permiso a la comisión ética de la Universidad de Costa Rica, Comité Ético Científico de la Universidad de Costa Rica para las investigaciones en las que participan seres humanos (CEC), pues se utilizaron especímenes dentales humanos para la prueba de liberación de calcio y pH. Financiamiento La inversión económica fue realizada por parte de los estudiantes a cargo del seminario de graduación para la compra de los envases de polietileno con tapa de 15 ml, polivinil siloxano de consistencia pesada PUTTY y los cementos bioactivos estudiados. Por parte del CELEQ, financió el 100% de las mediciones realizadas mediante espectroscopía de 32 absorbancia atómica con el equipo Perkin Elmer, modelo: AAnalyst 300 y pH con el equipo OAKTON, modelo: pH/CON 510 Series (incluyendo uso de cristalería, reactivos y el suministro de PBS). El LIMD financió el uso de la máquina de ensayo universal electrodinámica (Instron E3000) y la cortadora de precisión Buehler, Isomet 1000, y set de impresión 3D para aplicaciones odontológicas marca Asiga (modelo Max). 33 PARTE III: RESULTADOS 34 Resultados: Resistencia a la flexión y Módulo de flexión Tabla 1. Resistencia a la flexión (RF) y módulo de flexión (MF) en MPa para cada cemento bioactivo en estudio. Cemento RF (MPa) MF (MPa) ProRoot MTA 11,21 (3.93) A 1,48 (1.04) A Neoputty 8,63 (2.31) A 1,31 (1.57) A Bio C Repair 9,982 (3.27) A 0,88 (0.61) A Biodentine 9,120 (2.24) A 1.17 (0.57) A De acuerdo con la tabla 1, el MTA ProRoot se estableció como el cemento endodóntico bioactivo con mayor resistencia a la flexión con 11,21 MPa, mientras que el que registró menor valor correspondió al NeoPutty con 8,63 MPa. Resultados: Liberación de Iones de Ca2+ Tabla 2. Promedio (desviación estándar) de liberación de iones de calcio (mg/L) por cemento endodóntico bioactivo por día de medición, y valor acumulado a los 15 días Cemento Día 1mg/L(DE) Día 3 mg/L(DE) Día 5 mg/L (DE) Día 10 mg/L (DE) Día 15 mg/L(DE) Acumulativ o (mg/L) NeoPutty 1.56 (0.33) 1.29 (0.32) 1.15 (0.34) 1.6 (0.22) 1.26 (0.19) 6.86A ProRoot MTA 1.52 (0.08) 1.35 (0.35) 1.27 (0.22) 1.2 (0.12) 1.22 (0.21) 6.56A 35 Bio C Repair 1.76 (0.31) 0.89 (0.37) 1.26 (0.39) 1.26 (0.38) 1.05 (0.16) 6.22A Biodentine 0.63 (0.31) 0.47 (0.24) 1.31 (0.21) 0.61 (0.27) 0.80 (0.29) 3.82B Control Negativo 0.13 (0.15) 0.07 (0.10) 0.03 (0.05) 0.07 (0.05) 0.0 (0.0) 0.3 De acuerdo con la tabla 2, se puede afirmar que el NeoPutty corresponde al cemento endodóntico bioactivo que más iones de calcio liberó con un 6.86 mg/L, mientras que el Biodentine corresponde al cemento endodóntico bioactivo con menor liberación de iones calcio después de 15 días con un acumulado de 3.82 mg/L. Se realizan 2 análisis de significancia, uno en el día 1 (primer día de colecta) y otro en el día 15 (quinto día de colecta), ya que la investigación corresponde a una evaluación que se lleva a través del tiempo, por lo que de acuerdo con la tabla 6 y 7, se demostró que estadísticamente no existen diferencias entre ProRoot MTA, Bio C Repair y NeoPutty a través del tiempo; no obstante, sí existen diferencias estadísticamente significativas entre el Biodentine y el resto de cementos. La liberación promedio de iones calcio en el primer día, para los cementos NeoPutty, ProRoot MTA, Bio C Repair y Biodentine es 1.56 mg/L, 1.52 mg/L, 1.76 mg/L y 0.63 mg/L, respectivamente. Puede observarse que la mayor liberación la obtuvo el Bio C Repair y la menor fue para el del Biodentine; estadísticamente es significativa la diferencia entre todos los cementos con el Biodentine. Asimismo, la liberación promedio de iones calcio en el día 15, para los cementos NeoPutty, ProRoot MTA, Bio C Repair y Biodentine es 1.26 mg/L, 1.22 mg/L, 1.05 mg/L y 36 0.80 mg/L, respectivamente. Puede observarse que la mayor liberación se obtuvo con el NeoPutty y la menor fue la del Biodentine, y es estadísticamente significativa la diferencia entre todos los cementos con el Biodentine. Resultados: Cambio de pH en el medio de las muestras Tabla 3. Promedio de medición de pH y desviación estándar (DE) por cemento endodóntico bioactivo en cada día de medición. Cemento Día 1 (DE) Día 3 (DE) Día 5 (DE) Día 10 (DE) Día 15 (DE) NeoPutty 7,59 (0,08) 7,57 (0,04) 7,45 (0,03) 7,51 (0,03) 7,46 (0,02) ProRoot MTA 7,94 (0,13) 7,81 (0,08) 7,47 (0,04) 8,06 (0,14) 7,56 (0,04) Bio C Repair 7,71 (0,06) 7,58 (0,04) 7,45 (0,04) 7,57 (0,04) 7,48 (0,00) Biodentine 8,34 (0,54) 7,82 (0,17) 7,56 (0,04) 7,80 (0,07) 7,59 (0,08) Control Negativo 7,34 (0,04) 7,41 (0,01) 7,40 (0,00) 7,36 (0,01) 7,38 (0,01) 37 Figura 1. Gráfico de pH en cada día de medición. Al considerar la figura 1, se observa como el punto de pH más básico en el caso del Biodentine, Bio C Repair, NeoPutty corresponde al día 1; mientras que en el caso del ProRoot MTA corresponde al día 10. No obstante, todos los cementos endodónticos coinciden en que se da una marcada disminución en la medición de pH el día 5. Considerando la tabla 8, se puede señalar una diferencia estadísticamente significativa entre el valor de pH, en el día 1, del Biodentine con respecto a todos los demás cementos bioactivos, donde el Biodentine cuenta con el pH más alto, también existe una diferencia significativa entre el ProRoot MTA que supera al NeoPutty. Además, en el día 3 el Biodentine vuelve a mostrar una diferencia significativa con respecto al Bio C Repair y el NeoPutty, donde el Biodentine sigue siendo mayor. Para el día 5, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los cambios de pH de los cementos. Para el día 10, el pH del ProRoot MTA supera con diferencias significativa a todos los cementos del estudio, y adicionalmente el Biodentine es 38 mayor al BioC Repair y NeoPutty con diferencia significativa de su cambio de pH. El día 15 no se encontraron diferencias estadísticamente significativas. Tabla 4. Correlación de Pearson entre las variables liberación de calcio y pH por cemento. Cemento Correlación de Liberación de Ca2+ y cambio de pH Grado de correlación Tipo de correlación ProRoot MTA 0.11 Débil Directa Bio C Repair 0.49 Moderada Directa NeoPutty 0.53 Fuerte Directa Biodentine -0.59 Fuerte Inversa Respecto a la tabla 4, la correlación de las variables liberación de iones de calcio y cambio de pH, se determina que existe una correlación débil entre el aumento de liberación de iones calcio y el aumento de pH en el medio de la muestra para el ProRoot MTA. Por otra parte, existe una correlación moderada entre el aumento de liberación de iones calcio y el aumento de pH en el medio de la muestra para el Bio C Repair. Al considerar las dos variables para el NeoPutty, se encuentra una correlación fuerte entre ellas. Sin embargo, aunque todos los cementos tienen una correlación directa, el Biodentine cuenta con una inversa, lo que quiere decir que para este material hay una correlación fuerte entre el aumento de liberación de iones calcio y la disminución de pH en el medio de la muestra. 39 PARTE IV: DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES 40 En este estudio, la resistencia a la flexión fue evaluada con la finalidad de saber si existe una diferencia estadísticamente significativa entre los cementos bioactivos estudiados, a pesar de que todos estos cementos tienen composiciones diferentes, pero su principal componente activo es el silicato de calcio (39). Las pruebas de resistencia a la flexión son una medida colectiva, pues paralelamente se registra compresión en la superficie superior de la muestra y tensión de tracción en la superficie inferior. Actualmente, se prefieren las pruebas de flexión para materiales dentales frágiles como cementos, porque la distribución de tensiones simula de una forma más fiel de lo que ocurre en un contexto clínico (14) (40). Considerando la aplicación de los cementos bioactivos en endodoncia, se reconoce la existencia de una exposición a fuerzas de flexión y compresión (7), compatibles con oclusión fisiológica y patológica como las que se encuentran en mayor medida en pulpotomías, recubrimientos pulpares directos, y material reparador de perforaciones de furca, así como también la fuerza que se aplique para condensar o aplicar el material restaurador (41); asimismo, se han usado cementos bioactivos como materiales temporales de obturación expuestos a fuerzas mayores (42). De acuerdo con lo anterior, este estudio permite observar de forma aislada la resistencia a la flexión de cada cemento bioactivo, sin que se vea afectado por alguna estructura de soporte como lo realizan en otros estudios; como por ejemplo, piezas dentales, porque en investigaciones previas se observó que no hay diferencia en cuanto a los valores de resistencia a la flexión de piezas dentales obturadas y sin obturar con materiales biocerámicos (30). Por ello se confirma que evaluar dichas propiedades mecánicas responde más a la necesidad de considerar las fuerzas oclusales en sus aplicaciones clínicas coronales y al manipular el material en procedimientos de obturación (41). 41 Es pertinente desarrollar metodologías in vitro que permitan reproducir contextos clínicos lo más cercanos a la realidad, frente a la predominancia en cantidad de investigaciones del MTA sobre los demás cementos endodónticos (8), es necesario proponer metodologías que sean repetibles para que los resultados sean comparables entre las nuevas alternativas de cementos endodónticos, por ejemplo se han registrado diferencias significativas entre la resistencia flexural del MTA y el DiaRoot BioAggregate (41). Las muestras utilizadas en esta investigación se sometieron a un medio hermético con 100% de humedad, por lo cual se mantuvieron durante 48 horas constantemente hidratadas, con la finalidad de reproducir las condiciones ideales que deben tener estos cementos para obtener un nivel completo de fraguado (34). Estudios previos con metodologías similares consideran un medio hermético húmedo para el fraguado y posterior fractura de las muestras, de igual forma, usando PBS. Respecto al MTA, estos estudios previos (muestras 2 mm x 2 mm x 25 mm) han obtenido valores de 10.25 MPa y 11.27 MPa de resistencia flexural a las 96 horas (41). En esta investigación a pesar de tener diferencias de metodología referente a las dimensiones de las muestras (12 mm de longitud x 2 mm de altura x 2 mm de ancho) y momento de fractura (48 horas), se cuenta con valores para el ProRoot MTA de 11.21MPa a las 48 horas, lo cual es un valor similar a resultados previos. Los resultados son comparables, ya que en investigaciones como Moghaddam et al, 2018, sus dimensiones se preparan de acuerdo a la ISO 4049; en esta investigación se utilizó la prueba mini-flexural, por esto las dimensiones son diferentes a las utilizadas en la literatura previa; no obstante según Yap et al, 2018, se ha descrito una fuerte correlación entre la ISO 4049 y la prueba mini-flexural, así como su gran relevancia clínica y mayor eficiencia, lo cual constituye una opción de reemplazo para la ISO 4049 (37). 42 Estudios sobre propiedades mecánicas de cementos bioactivos registran un aumento en su resistencia a la flexión de las primeras 24 horas a los 21 días (14) (40); es decir, existe un interés por considerar el tiempo de fraguado del material, antes de someterle a la prueba de resistencia a la flexión y su relación con el resultado, este estudio contó con 48 horas de fraguado para todas sus muestras y obtuvo como resultado el MTA de 11.21 MPa, mientras que la literatura previa reporta 14,27 MPa a las 24 horas, 11.18MPa a las 72 horas (14)(40) y, 10.25 MPa y 11.27 a las 96 horas (41). De acuerdo con lo anterior, se deben realizar estudios que consideren grupos en diferentes tiempos de fraguado para comprobar la correlación de aumento de tiempo y aumento de resistencia a la flexión, pues de los resultados en este estudio y los descritos en la literatura no reportan el comportamiento exponencial que se espera a través del tiempo. Asimismo, se tiene un valor que ha sido registrado en esta investigación a las 48 horas que es similar al obtenido a las 96 horas (41). Los aluminatos que contienen los cementos biocerámicos son los que generan su fragilidad (25), mientras que la resistencia de los cementos bioactivos se puede deber a la formación de portlandita, producida cuando el silicato de calcio es hidratado; esto ocurre en la fase de unión primaria del cemento, en donde son partículas nanoporosas amorfas, las cuales rodean los granos de estos materiales, de este modo se genera su resistencia; de hecho, en estudios previos se sometió un MTA experimental y se afirmó que su baja resistencia se debía a su deficiente hidratación (35). La fase de portlandita ayuda a generar resistencia porque nuclea y crece dentro de los poros de estos cementos. En un estudio se analizó la porosidad del Biodentine y el ProRoot MTA mediante tomografía microcomputarizada y se logró constatar que el Biodentine posee menos poros que el MTA (43). En la literatura se describe una superioridad del Biodentine en sus propiedades mecánicas respecto a otros cementos bioactivos, la casa comercial reporta valores de 34 MPa 43 de resistencia a la flexión después de 2 horas de fraguado, incluso se señala que la mayor resistencia del biodentine se debe a la utilización del polímero hidrosoluble, este permite reducir la relación agua/cemento (14) (28); sin embargo, si se considera que las propiedades mecánicas de estos cementos aumentan con el paso del tiempo por la constante hidratación y formación de portlandita (35) (27), la superioridad del Biodentine no es un hecho confirmado con esta investigación. El valor obtenido a la resistencia flexural fue de 9.12 MPa a las 48 horas de fraguado y es menor a los valores obtenidos para el Bio C Repair y ProRoot MTA; por ello, según los resultados de este estudio se difiere con los descritos en Escorcia et al 2020, donde se plantea 34 MPa a las 2 horas de su fraguado (28) aunque las mediciones se realizan en un tiempo posterior al fraguado diferente, es bien conocido la característica del aumento en resistencia flexural con el paso del tiempo en cementos bioactivos, por lo que el resultado a las 48 horas debería ser mayor al de las 2 horas, no obstante se encuentra lo contrario (27). De acuerdo con los resultados de esta investigación se puede cuestionar si realmente las diferencias en la presentación de cementos bioactivos responden a una elección para un tratamiento o a su manejo clínico sin tener diferencias en su desempeño mecánico. Se ha planteado que las presentaciones en consistencia tipo putty, surgen para su empleo en recubrimientos pulpares directos y procedimientos restaurativos endodónticos; o sea, procedimientos en los cuales se tiene por ende más exposición a fuerzas que ponen a prueba la resistencia del material (16) (41). No obstante, al evaluar la consistencia putty del NeoPutty, se encuentra que no existe una diferencia significativa con cementos endodónticos en presentación de polvo-líquido; adicionalmente, el NeoPutty es el cemento endodóntico con menor resistencia flexural de todos los cementos endodónticos que formaron parte de esta investigación. 44 El desempeño mecánico que cumplen los cementos endodónticos bioactivos como material restaurador es cuestionable; por ello, resulta importante valorar estudios sobre resistencia flexural los cuales se extrapolen a su uso clínico. Asimismo, se ha reportado su uso como materiales de obturación temporal, sin embargo la literatura reporta valores de entre 47 y 120 MPa para materiales restaurativos temporales (44). Los obtenidos a las 48 horas siguen siendo valores de resistencia inferiores a los que presentan otros materiales temporales, por lo cual se debe cuestionar si ante fuerzas oclusivas y conceptualizadas como un material de obturación temporal, realmente se comportan mecánicamente de la mejor forma, pues en torno al tema existen reportes de restauraciones donde además de funcionar como recubrimiento pulpar directo, se obtura la cavidad por completo con el material, incluso en restauraciones CII MOD, y se deja el cemento bioactivo Biodentine actuar durante 6 meses en un cavidad (44). En este tipo de restauraciones, el material está expuesto a saliva y fuerzas oclusales desde el momento en el cual se realiza el procedimiento; por ello, existe la necesidad de investigar las condiciones de estas prácticas terapéuticas y el desempeño de sus propiedades mecánicas, para la práctica de una odontología basada en evidencia. Investigaciones previas tales como Escorcia et al, 2020 reportan valores altos de resistencia a la flexión para el Biodentine, específicamente de 34 MPa (14), sin embargo otras reportan valores inferiores similares a las obtenidas en este estudio de 9.49 MPa, como Alhodiry et al, 2014, donde se obtuvieron valores similares (45). La liberación de iones calcio es un factor que contribuye al éxito en procedimientos endodónticos, debido a que este actúa sobre la mineralización en los tejidos duros del diente y señalización en este proceso. El calcio aumenta la migración de las células hacia la pulpa 45 dental, esto también aumenta la actividad de la pirofosfatasa, que ayuda a mantener la mineralización de la dentina. Adicionalmente, la bioactividad de los biomateriales se atribuye a su capacidad de liberación de iones de calcio y producción de precipitados cristalinos similares a la apatita al entrar en contacto con fluidos fisiológicos contenidos de fosfato (46) (47). De acuerdo con lo anterior, se decide utilizar una solución de PBS a 37 C° que contiene fosfato para imitar las condiciones normales fisiológicas in vivo en laboratorio. El alto contenido de fosfato del PBS representa la reposición continua de este ion en los tejidos tisulares y en ausencia de calcio, la liberación de calcio de los cementos se convierte en un parámetro limitante en la reacción de precipitación y constituye la bioactividad del cemento (47). Existen propiedades biointeractivas de los iones liberados, sin embargo, el aumento del pH y la alta concentración de calcio mejoran la sobresaturación de la solución del PBS con respecto a la apatita y se promueve la precipitación de la capa de recubrimiento de apatita carbonatada sobre la superficie del cemento (48). Los precipitados han sido descritos como “apatita carbonatada” deficiente en hidroxiapatita o calcio; es decir, fosfato de calcio amorfo (ACP), también llamado apatita biológica de la fase del tejido duro (hueso, dentina y cemento) (47). La metodología de esta investigación permite analizar la capacidad de liberación de iones de calcio de 4 materiales bioactivos, lo cual es fundamental para la formación de precipitados, que actúan sobre la apatita; el precipitado es dependiente de una fase metaestable de fosfato cálcico amorfo en una fase de apatita y la transformación autocatalítica mediada por el cambio de pH que se sufre, se incorporan elementos en su estructura y se sustituyen, lo cual ocasiona alteraciones morfológicas (48). 46 Actualmente existe la necesidad de evaluar las propiedades bioactivas de las nuevas alternativas de cementos endodónticos bioactivos que forman parte de los biomateriales empleados cotidianamente en la clínica (8). Al considerar los resultados de esta investigación expuestos en las tablas 6 y 7, no se encuentran diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la liberación de iones calcio entre los cementos ProRoot MTA, Bio C Repair y NeoPutty; no obstante, sí la hay con respecto al Biodentine y ello lo posiciona como la alternativa con la capacidad de liberación de iones calcio más baja. Asimismo, los resultados de esta investigación coinciden con hallazgos descriptivos sobre una mayoría de “nódulos de mineralización” encontrados en el NeoPutty sobre el MTA (13). Existe una gran diversidad de metodologías empleadas para medir la liberación de iones de calcio, donde difieren los medios de inmersión de las muestras (49) (46) (50), la metodología empleada en esta investigación se acerca mucho a lo que se propone en Retana- Lobo et al (5) con la diferencia de que en vez de ser 30 mL de PBS, las muestras estuvieron sumergidas en 10 mL, con el fin de recrear un medio fisiológico con iones fosfato (47) Existen estudios que indican que el Biodentine constituye una opción de cemento bioactivo con una capacidad de liberación de iones de calcio aumentada con respecto al MTA y otras alternativas de cementos bioactivos endodónticos (47) (51); sin embargo, esto no concuerda con lo que resulta del modelo experimental utilizado en esta investigación, donde el Biodentine tiene diferencias significativas menores en cuanto a su capacidad de liberación iónica con los demás cementos (incluido el MTA). 47 Igualmente, existen estudios como Kumari et al 2018 que respaldan con sus resultados la tendencia que se encuentra en esta investigación, donde el Biodentine presenta una capacidad de liberación iónica 58% menor al MTA (46) La razón de la diferencia entre la liberación de iones calcio entre cementos se puede deber a los aspectos diferenciales con los que cuenta el Biodentine, entre estos es su composición a razón de una acelerada reacción. La presencia del carbonato de calcio ha demostrado tener un papel relevante en la reacción de hidratación, por lo cual produce sitios de nucleación, acelerando la cinética del fraguado (47) (46). El cloruro de calcio corresponde a otro componente del Biodetine que acelera la reacción de hidratación y favorece la deposición de fosfato de calcio. Por otra parte, la liberación de calcio alta de los cementos tipo putty, como el Bio C Repair y el NeoPutty, puede deberse a su consistencia, pues se encuentran asociados a una reacción de hidratación más lenta, en comparación con el Biodentine del que se describe una hidratación rápida (46). Asimismo, se señala que el Biodentine no posee silicato dicálcico en su composición que se asocia a una reacción más lenta de hidratación (47). Se ha asociado la búsqueda de una reacción más rápida de fraguado en el Biodentine mediante estos compuestos a un desempeño mecánico mayor del material (35); no obstante, queda demostrado en esta investigación que respecto a la resistencia a la flexión no hay diferencias estadísticamente significativas entre el Biodentine y las otras alternativas de cementos endodónticos bioactivos, de ello resulta la aceleración de la reacción como un aspecto que no tiene influencia en la resistencia mecánica del material. Respecto al pH, como se ha planteado, el mismo mecanismo de bioactividad incluye una alcalinización del medio que confiere propiedades bactericidas y condiciones óptimas 48 para que la bioactividad del biomaterial se desarrolle, por medio de la disociación de iones calcio e hidroxilo. Lo ideal en un material biocerámico es que la alcalinización se sostenga a lo largo del tiempo, además de favorecer la precipitación de apatita (50) (34) (47) (51) (47). Es predominante el reporte de medios alcalinos al utilizar cementos bioactivos endodónticos; sin embargo, se reportan valores diferentes entre investigaciones. Es pertinente señalar que en investigación in vitro e in vivo se ha determinado que un pH mayor 8,0 inhibe el proceso de mineralización (50). Además, se debe considerar la existencia de estudios que reportan valores con rangos de 9,5-11, (47) y 8,0-11,3 (5) por lo cual estos inhibirán dicho proceso. A pesar de que los resultados de esta investigación cuenta con un rango de valores menores 7,45-8,34, se considera coincidente con lo descrito en investigaciones in vitro e in vivo, porque estos materiales están hechos para promover la mineralización (50). En este estudio las muestras han generado un pico de pH en sus primeras 24 horas, luego decrece y genera otro pico en el décimo día de medición, esto sugiere que con el paso del tiempo estos materiales preservan sus propiedades, logrando de esta manera contrarrestar infecciones crónicas, tales como la periodontitis apical asintomática (47). El comportamiento de estas muestras indica que el Biodentine fue el material con el pico de pH más alto en sus primeras 24 horas, con una diferencia significativa con respecto a los otros cementos, pero en el décimo día fue superado por el ProRoot MTA. Por otra parte, el Biodentine, Bio C Repair y NeoPutty cuentan con el pH más alcalino al día 1, mientras que el ProRoot MTA lo presentó hasta el día 10. Este comportamiento diverge de una tendencia en la que el pH va decayendo a través del tiempo, si no que se acerca más a una propiedad 49 ideal de mantener un medio alcalino sostenidamente en tiempo (50). Asimismo, el Bio C Repair y el NeoPutty tienden a tener la misma tendencia en magnitudes menores. En la literatura se correlaciona la liberación de iones calcio y alcalinización del medio, donde se establece una mayor liberación iónica a un mayor pH (5). No obstante, se debe comprender que los cementos bioactivos endodónticos son compuestos que alcalinizan el medio por medio de la liberación de iones hidroxilo, no la liberación de iones calcio (52). Además, puede existir un grado de correlación debido a que la liberación de iones calcio está ligada a la de iones hidroxilo; sin embargo, existen compuestos que no están formados por calcio que contienen iones hidroxilo, así como también los iones hidroxilo pueden estar formando parte de precipitados y la medición del calcio no da información directa sobre los iones hidroxilos libres que alcalinizan el medio. Asimismo, estas correlaciones no se comprueban estadísticamente en la literatura disponible, de la misma manera que se hace en este estudio. Este estudio demostró que el MTA ProRoot presenta una correlación entre el aumento de liberación de iones calcio con un aumento de pH débil. Ello confirma que la liberación de iones de calcio no es un dato directo para valorar la alcalinización del medio. Por otra parte, el Bio C Repair tiene una relación moderada y NeoPutty una correlación fuerte. Además, se encontró una correlación inversa fuerte en el caso del Biodentine lo cual quiere decir que al disminuir el pH si puede aumentar la liberación de iones calcio. De acuerdo con lo anterior, se reafirma la necesidad de conceptualizar estas variables como una correlación que varía entre alternativas de cemento endodóntico y se rigen a través de reacciones químicas y momentos de cristalización que no se tienen completamente caracterizadas actualmente en la línea de investigación. La relación inversa del Biodentine se 50 podría explicar debido a la caída que ocurre del día 1 al día 5, se deben realizar investigaciones que confirmen el efecto que tiene el pH en los precipitados que se encuentran formados con anterioridad en las muestras, porque el aumento de liberación de iones calcio se puede deber a que estos provengan de los mismos precipitados, debido a caídas de pH que promuevan su salida y conformación; al observar, se puede señalar como el día con mayor caída de pH en el Biodentine (de un 8.34 a un 7.56) al día con mayor liberación de iones calcio (1,31 mg/L). Conclusiones • No existen diferencias significativas de resistencia a la flexión para NeoPutty, el Bio C Repair, ProRoot MTA y Biodentine. No obstante, los valores encontrados son muy bajos para considerarlos materiales restauradores definitivos. • El Biodentine presenta una liberación de iones calcio significativamente más baja que los otros cementos evaluados. • A pesar de existir correlaciones entre el aumento de pH y la liberación de iones calcio, la variabilidad no permite establecer un patrón sobre la relación de las variables. • Descriptivamente las medidas de pH determinan que el punto de pH más básico en el caso del Biodentine, Bio C Repair, y NeoPutty corresponde a el día 1, mientras que en el caso del ProRoot MTA corresponde al día 10. Asimismo, todos los cementos endodónticos coinciden en que se da una marcada disminución en la medición de pH el día 5. 51 REFERENCIAS 1. Niu, L. N., Jiao, K., Wang, T. da, Zhang, W., Camilleri, J., Bergeron, B. E., Feng, H. L., Mao, J., Chen, J. H., Pashley, D. H., & Tay, F. R. . A Review of the Bioactivity of Hydraulic Calcium Silicate Cements. 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Par de cementos Diferencia (MPa) Valor p Error Estándar Bio C Repair ProRoot MTA -1,231 0,799 1,3518 Neoputty 1,349 0,752 1,3518 Biodentine 0,862 0,919 1,3518 ProRoot MTA Neo Putty 2,580 0,242 1,3518 Bio C Repair 1,231 0,799 1,3518 Biodentine 2,093 0,420 1,3518 Neoputty ProRoot MTA -2,580 0,242 1,3518 Bio C Repair -1,349 0,752 1,3518 Biodentine -0,487 0,984 1,3518 Biodentine ProRoot MTA -2,093 0,420 1,3518 Neoputty 0,487 0,984 1,3518 62 Bio C Repair -0,862 0,919 1,3518 *diferencia significativa al 0.05 Tabla 6. Diferencia, valor p e intervalo de confianza para prueba de hipótesis de igualdad de medias entre cementos al 0.05 de significancia en el primer día de colecta o día 1 después de la obturación de la muestra. Par de cementos Diferencia (mg/L) Valor p Error Estándar Intervalo de Confianza al 95% Lím. Inferior Lím. Superior Bio C Repair Protoot MTA 0.02 0.54 0.24 NeoPutty 0.03 0.44 0.24 Biodentine 1.27 < 0.01* 0.24 0.95 1.59 ProRoot MTA NeoPutty 0.006 0.49 0.24 Biodentine 1.25 < 0.01* 0.24 0.83 1.66 NeoPutty Biodentine 1.24 < 0.01* 0.24 0.92 1.56 *diferencia significativa al 0.05 Tabla 7. Diferencia, valor p e intervalo de confianza para prueba de hipótesis de igualdad de medias entre cementos al 0.05 de significancia en el quinto día de colecta o día 15 después de la obturación de la muestra. 63 Par de cementos Diferencia (mg/L) Valor p Error Estándar Intervalo de Confianza al 95% Lím. Inferior Lím. Superior NeoPutty ProRoot MTA 0.09 0.63 0.28 Bio C Repair 0.18 0.79 0.28 Biodentine 1.79 < 0.01* 0.28 1.43 2.17 ProRoot MTA Bio C Repair 0.08 0.39 0.28 Biodentine 1.70 < 0.01* 0.28 1.22 2.19 Bio C Repair Biodentine 1.62 < 0.01* 0.28 1.26 1.99 *diferencia significativa al 0.05 Tabla 8. Diferencia, valor p e intervalo de confianza para prueba de hipótesis de igualdad de medias de nivel de pH entre cementos al 0.05 de significancia en cada día de colecta Día Par de cementos Diferencia Valor p Error Estándar Intervalo de Confianza al 95% Lím. Inferior Lím. Superior 1 Biodentine Proroot MTA 0.40 < 0.01* 0.09 0.31 0.49 Bio C Repair 0.62 < 0.01* 0.07 0.56 0.69 Neoputty 0.75 < 0.01* 0.07 0.68 0.82 ProRoot MTA Neoputty 0.35 < 0.01* 0.09 0.35 0.35 Bio C Repair 1.70 0.06 0.09 Bio C Repair Neoputty 0.13 0.36 0.07 3 Biodentine Proroot MTA 0.01 1 0.09 Bio C Repair 0.24 < 0.01* 0.07 0.17 0.31 Neoputty 0.25 < 0.01* 0.07 0.18 0.31 Proroot MTA Neoputty 0.24 0.05 0.09 Bio C Repair 0.23 0.07 0.09 Bio C Repair Neoputty 0.01 1 0.07 64 5 Biodentine Proroot MTA 0.09 1 0.09 Bio C Repair 0.11 0.63 0.07 Neoputty 0.11 0.50 0.07 Proroot MTA Neoputty 0.02 1 0.09 Bio C Repair 0.01 1 0.09 Bio C Repair Neoputty 0.01 1 0.07 10 Proroot MTA Bio C Repair 0.49 <0.01* 0.09 0.49 0.49 Neoputty 0.55 <0.01* 0.09 0.55 0.55 Biodentine 0.26 0.02* 0.09 0.26 0.26 Biodentine Bio C Repair 0.23 <0.01* 0.07 0.16 0.30 Neoputty 0.29 <0.01* 0.07 0.22 0.35 Bio C Repair Neoputty 0.05 1 0.07 15 Biodentine Proroot MTA 0.04 1 0.09 Bio C Repair 0.11 0.54 0.07 Neoputty 0.13 0.28 0.07 Proroot MTA Bio C Repair 0.08 1 0.09 Neoputty 0.10 1 0.09 Bio C Repair Neoputty 0.02 1 0.07 *diferencia significativa al 0.05 65 ANEXOS Figura 2. Preparación de discos de dentina para prueba de liberación de iones de Ca2+ A. discos de dentina de 2 mm estandarizados con broca 6 Gates Glidden B. Obturación de discos C. Inmersión de discos obturados en PBS. Figura 3. Manipulación de discos de dentina para prueba de liberación de iones de Ca2+ . A. Discos de dentina almacenados en envases de polietileno de 15 ml rotulados a 37C°. B. Absorbancia atómica de muestra decantada en un tubo de sedimentación. 66 Figura 4. Preparación de muestras para prueba de resistencia a la flexión. A. Molde en positivo impreso en resina 3D junto con moldes en putty listos para ser obturados. Obturación de los moldes en putty para obtener las muestras. Figura 5. Prueba de Resistencia a la flexión. A. Barra posicionada para prueba B. Barra fracturada.