UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO DETERMINACIÓN IN VITRO DE LAS ACTIVIDADES ANTIOXIDANTE Y ANTIBACTERIANA DE LOS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS DE DIFERENTES PARTES ANATÓMICAS DE IMPATIENS HAWKERI (BALSAMINACEAE) Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencias Biomédicas para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencias Biomédicas con Énfasis en Bioquímica y Fisiología Celular FABIÁN DELGADO RODRÍGUEZ Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2023 ii DEDICATORIA A la memoria de mi abuela, Jovita Zeledón Oviedo, quien inspiró mi interés por las plantas desde mi niñez. A mi madre, Verena Rodríguez Zeledón, y a mi padre, Vinicio Delgado Quintana, por su apoyo a lo largo de mi formación académica y vida profesional. iii AGRADECIMIENTOS A los miembros del Comité Asesor, por su anuencia a aceptar el tema de investigación como Trabajo Final de Graduación y por todo su apoyo logístico y recomendaciones aportadas a lo largo de la ejecución del presente trabajo. A la Vicerrectoría de Investigación (UCR), el Instituto de Investigaciones Farmacéuticas (Facultad de Farmacia. UCR) y al Laboratorio de Investigación en Bioquímica (Departamento de Bioquímica, Escuela de Medicina, UCR), por el apoyo logístico, técnico y/o financiero al proyecto de investigación bajo cuyo marco se desarrolló el presente Trabajo Final de Graduación. Al Laboratorio de Farmacognosia (Facultad de Farmacia, UCR), y al Programa de Posgrado en Ciencias Biomédicas (Escuela de Medicina, UCR) por su apoyo logístico y/o financiero al presente Trabajo Final de Graduación. Al señor Alexis Torres y a las señoras Ana Lorena Torres y María Fernanda Morales, por su ayuda técnica a lo largo de la ejecución del presente trabajo. A los animales de investigación, cuyo sacrificio fue transcendental para la generación de parte de los resultados de este estudio, así como de todos aquellos cuya vida ha sido transcendental para el progreso de la Ciencia y la Tecnología. iv “Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencias Biomédicas de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencias Biomédicas con Énfasis en Bioquímica y Fisiología Celular” v TABLA DE CONTENIDOS Dedicatoria ………………………….…………………………………………. ii Agradecimientos …………………………………………………………...….. iii Hoja de aprobación ……………………………………………………………. iv Tabla de contenidos …………………………………………………………… v Resumen ………………………………………………………………………. ix Abstract ……………………………………………………………………….. x Lista de cuadros ……………………………………………………………….. xi Lista de figuras ………………………………………………………..……….. xiii Lista de abreviaturas ………………………………………...………..……….. xv Lista de ecuaciones ……………………………………………………..……... xxii 1. Introducción ………………………………………………………………… 1 1.1. Especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS) y el estrés oxidativo ………………………………………………………………………. 1 1.1.1. Principales fuentes de ROS y RNS ……………………………………... 1 1.1.2. Sistemas antioxidantes y definición de estrés oxidativo………………... 3 1.1.3. Estrés oxidativo y su relación con patologías …………………………... 6 1.2. Propiedades antioxidantes de los compuestos fenólicos de origen vegetal . 14 1.3. Infecciones bacterianas y la necesidad de nuevos agentes antibacterianos . 19 1.4. Las plantas como fuente de moléculas antibacterianas …………………… 26 2. Justificación ………………………………………………………………… 29 vi 3. Hipótesis y objetivos ……………………………………………………….. 31 3.1. Hipótesis ………………………………………………………………….. 31 3.2. Objetivos…………………………………………………….…………….. 31 3.2.1. Objetivo general ….……………………………………….……………. 31 3.2.2. Objetivos específicos …………….………………………….………….. 31 4. Materiales y métodos …………………………………….…………………. 33 4.1. Recolección y procesamiento del material vegetal ………………….……. 33 4.2. Preparación de los extractos hidroalcohólicos …………………….…….… 34 4.3. Análisis de los extractos mediante cromatografía en capa fina de alto desempeño (HPTLC) ……………………………………………………... 35 4.3.1. Condiciones cromatográficas generales ………………………………… 35 4.3.2. Condiciones para la determinación simultánea de quercetina y kaempferol .……………………………………………………………… 37 4.3.3. Condiciones para la determinación simultánea de rutina e isoquercetina 38 4.3.4. Condiciones para la determinación simultánea de lawsona y 2-MNQ …. 38 4.3.5. Condiciones para la determinación de escopoletina ……………………. 39 4.4. Determinación del contenido de compuestos fenólicos totales (TPC) …….. 40 4.5. Determinación del contenido de flavonoides totales (TFC) …….………... 41 4.6. Determinación del contenido de antocianinas monoméricas totales (TMA) 42 4.7. Evaluación in vitro de la actividad antioxidante mediante ensayos químicos 43 4.7.1. Capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC) ……………... 43 4.7.2. Actividad barredora sobre el radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) 45 4.7.3. Potencial antioxidante reductor férrico (FRAP) ……………….………... 46 vii 4.7.4. Determinación de la actividad quelante sobre el ion hierro II (FIC) ……. 47 4.8. Evaluación in vitro de la actividad antioxidante mediante ensayos biológicos ……………………………………………………………….. 48 4.8.1. Inhibición de la peroxidación lipídica de homogenizados de hígado de rata (LPO) ………………………………………...……….…………….. 48 4.8.2. Actividad antioxidante celular de eritrocitos (ERYCA) …………………. 51 4.8.3. Determinación de la capacidad de estabilización de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares …………………....……………….……… 52 4.8.3.1. Determinación preliminar de la citotoxicidad de los extractos …….…. 52 4.8.3.2. Determinación del potencial reductor de ROS a nivel intracelular .…... 53 4.9. Determinación de la actividad antibacteriana in vitro …………….………. 55 4.10. Análisis estadístico de resultados …………….………………………….. 57 5. Resultados y discusión …………….………………………………………… 59 5.1. Determinación de compuestos biológicos bioactivos por cromatografía HPTLC ………………………………….……….……………………..... 59 5.2. Cuantificación colorimétrica de compuestos fenólicos totales (TPC), flavonoides totales (TFC) y antocianinas monoméricas totales (TMA) ….. 73 5.3. Evaluación in vitro de la actividad antioxidante mediante ensayos químicos 79 5.4. Evaluación in vitro de la actividad antioxidante mediante ensayos biológicos ……………………………………...………………………….. 87 5.5. Determinación de la actividad antibacteriana in vitro ………….…………. 96 5.6. Resultados de los análisis de correlación y PCA ……………………….…. 102 6. Conclusiones y recomendaciones …………………………………………… 110 7. Referencias ………………………………………………….………………. 113 viii 8. Anexos ………………………….…………………………………………… 163 8.1. Estimación del porcentaje del peso total de las plantas de I. hawkeri correspondiente a cada sección anatómica ……………………..…………. 163 8.2. Perdida de humedad del material vegetal durante la fase de secado ……… 164 8.3. Rendimiento de extracción …………………….………………………….. 165 8.4. Parámetros analíticos de los ensayos por cromatografía HPTLC …….…… 166 8.5. Ejemplos de densitogramas procesados en los análisis por cromatografía HPTLC ……………………………………………………………………. 168 8.6. Gráfico de tendencias dosis respuesta observada en el ensayo de determinación de la inhibición de la producción de ROS a nivel intracelular 189 8.7. Valores para las variables SCF e IAB empleadas para los análisis de correlación y PCA ……………………………….………………………… 190 8.8. Resultados de análisis PCA establecido mediante la selección de los tres componentes principales con mayor varianza ………………….…………. 191 ix RESUMEN Los extractos de plantas ricos en compuestos fenólicos se caracterizan por su capacidad antioxidante, lo que plantea que su consumo puede reducir la incidencia y progresión de patologías asociadas al estrés oxidativo. Además, este tipo de sustancia puede presentar actividad antibacteriana, la cual puede ser aprovechada para el desarrollo de nuevos antimicrobianos. El género Impatiens presenta plantas cuyos extractos y metabolitos fenólicos han demostrado previamente actividad antioxidante y antibacteriana. Por este motivo y por la relevancia de hallar agentes antibacterianos y antioxidantes, se realizó el estudio comparativo de la composición de compuestos fenólicos y de las actividades antibacteriana y antioxidante de los extractos hidroalcohólicos de diferentes partes anatómicas de Impatiens hawkeri. Además, se estudió el efecto de la técnica de secado de las hojas sobre los mismos parámetros. Entre los compuestos bioactivos identificados de manera tentativa en los extractos mediante cromatografía de capa fina de alto desempeño (HPTLC) se encuentran quercetina, kaempferol, rutina, isoquercetina, lawsona y escopoletina. Los resultados de ensayos de cuantificación indican que las hojas y flores son la fuente más rica en compuestos fenólicos, flavonoides y antocianinas. Los extractos de estas partes de la planta presentan la mayor actividad antioxidante y el mayor efecto antibacteriano. El secado de las hojas influye en la concentración de metabolitos fenólicos, y en las actividades antioxidante y antibacteriana de sus extractos hidroalcohólicos. Los extractos con actividad antibacteriana presentan un efecto inhibitorio débil sobre el crecimiento de bacterias Gram-positivas. Los análisis de correlación y de componentes principales revelan la existencia de una asociación entre las actividades antioxidante y antibacteriana de los extractos con las cantidades de compuestos fenólicos y flavonoides. Los resultados demuestran que el extracto obtenido de hojas liofilizadas es el que presenta mayor capacidad antioxidante, mientras que el extracto de hojas secadas al horno presenta un mejor perfil de actividad antibacteriana. x ABSTRACT Plant extracts rich in phenolic compounds are characterized by their antioxidant capacity. It has been proposed that their consumption can reduce the incidence and progression of oxidative stress associated illnesses. In addition, this kind of metabolites can show antibacterial activity and are considered as a potential source of new antimicrobials. There are previous reports of extracts and phenolic metabolites derived from Impatiens genus that have demonstrated antioxidant and antibacterial activity. Considering this background and the relevance of the research for the discovery of antibacterial and antioxidant agents, a comparative study of the composition of phenolic compounds and the antibacterial and antioxidant activities of the hydroalcoholic extracts from different anatomical parts of Impatiens hawkeri was carried out. Additionally, the effect of drying technique applied to leaves on the same properties was also studied. Quercetin, kaempferol, rutin, isoquercetin, lawsone, and scopoletin are among the bioactive compounds tentatively identified in the extracts by high performance thin layer chromatography (HPTLC). The results of quantification assays indicate that leaves and flowers are the richest sources of phenolic compounds, flavonoids and anthocyanins. The extracts of these parts of the plant have the highest antioxidant activity and the highest antibacterial effect. The drying technique applied on leaves influences the concentration of phenolic compounds, and the antioxidant and antibacterial activities of their hydroalcoholic extracts. Extracts with antibacterial activity have a weak inhibitory effect on Gram-positive bacteria growth. Correlation and principal component analyzes demonstrated an association between the antioxidant and antibacterial activities of the extracts with their contents of phenolic compounds and flavonoids. The results show that the extract obtained from freeze-dried leaves is the one with the highest antioxidant capacity, while the extract from oven-dried leaves has the best antibacterial activity profile. xi LISTA DE CUADROS Cuadro I. Principales factores generadores de ROS y RNS a nivel celular …... 2 Cuadro II. Principales sistemas antioxidantes endógenos …………………… 4 Cuadro III. Principales infecciones provocadas por las especies de bacterias patógenas sobre las que se evalúo la actividad antibacteriana de los extractos de I. hawkeri ………………………………………………………….……………… 25 Cuadro IV. Códigos asignados a los diferentes extractos hidroalcohólicos de I. hawkeri sujetos a estudio.…………………………………….…………… 35 Cuadro V. Contenido de compuestos fenólicos bioactivos en los extractos de diferentes partes anatómicas de I. hawkeri ………………...…………….. 65 Cuadro VI. Contenido de compuestos fenólicos bioactivos en los extractos de hojas de I. hawkeri sometidas a secado bajo diferentes técnicas ……………. 68 Cuadro VII. Determinación colorimétrica de compuestos fenólicos totales (TPC), flavonoides totales (TFC) y antocianinas monoméricas totales (TMA) en los extractos de diferentes partes anatómicas de I. hawkeri ……………… 74 Cuadro VIII. Determinación colorimétrica de compuestos fenólicos totales (TPC), flavonoides totales (TFC) y antocianinas monoméricas totales (TMA) en los extractos de hojas de I. hawkeri sometidas a secado mediante diferentes técnicas ………………………………………………………………………. 76 Cuadro IX. Actividad antioxidante in vitro de los extractos de diferentes partes anatómicas de I. hawkeri ……………………………………………… 81 Cuadro X. Actividad antioxidante in vitro de los extractos de hojas de I. hawkeri sometidas a secado mediante diferentes técnicas …………………... 83 Cuadro XI. Valores de CMI determinados para los extractos de diferentes partes anatómicas de I. hawkeri sobre las distintas bacterias de prueba ……… 97 Cuadro XII. Valores de CMI determinados para los extractos de hojas de I. hawkeri sometidas a secado mediante diferentes técnicas …………………… 99 Cuadro A1. Porcentaje del peso promedio de la planta de I. hawkeri que corresponde a cada parte o sección anatómica ………………………..……… 163 xii Cuadro A2. Perdida de humedad del material vegetal durante la fase de secado ……………………..……………………………………….………… 164 Cuadro A3. Porcentaje de rendimiento para los procesos de extracción con los diferentes tipos de material vegetal de I. hawkeri ……………………….. 165 Cuadro A4. Parámetros analíticos de los métodos empleados para la determinación de compuestos fenólicos bioactivos ………..………………… 167 Cuadro A5. Valores de las variables SCF e IAB para cada extracto ….……. 190 xiii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estructura química de ejemplos de los principales tipos de compuestos fenólicos de origen vegetal ……………………………………. 14 Figura 2. Esquema de los mecanismos químicos de actividad antioxidante de los compuestos fenólicos.……………………………………………………. 18 Figura 3. Cromatogramas para la determinación de quercetina, kaempferol, rutina, isoquercetina, lawsona, 2-MNQ y escopoletina ……………………… 62 Figura 4. Actividad antioxidante determinada mediante el ensayo de inhibición de la peroxidación lipídica (LPO) de homogenizados de hígado de rata ………………………………………………..………………………….. 88 Figura 5. Actividad antioxidante determinada mediante el ensayo ERYCA … 90 Figura 6. Prueba de citotoxicidad sobre células Vero preliminar al ensayo de inhibición de la producción de ROS a nivel intracelular ……………………... 92 Figura 7. Ensayo de inhibición de la producción de ROS (IROS) a nivel intracelular en células Vero ………………………..………………………… 93 Figura 8. Matriz de correlación de Spearman entre los diferentes parámetros determinados para los nueve extractos estudiados .…………………………. 102 Figura 9. Análisis PCA bidimensional para los diferentes parámetros evaluados en los extractos sujetos a estudio ……………………….………… 105 Figura A1. Densitogramas de absorbancia para la determinación de quercetina (1) y kaempferol (2) obtenidos a 380 nm después del desarrollo de la placa de cromatografía con la fase móvil 1 ……………………………….. 168 Figura A2. Densitogramas de absorbancia para la determinación de quercetina (1) y kaempferol (2) obtenidos a 380 nm después del desarrollo consecutivo de la placa de cromatografía con las fases móviles 1 y 2 ………... 169 xiv Figura A3. Densitogramas de absorbancia para la determinación de rutina (1) e isoquercetina (2) obtenidos a 365 nm después del desarrollo de la placa de cromatografía con la fase móvil 3 ………………………………….……….. 174 Figura A4. Densitogramas de absorbancia para la determinación de lawsona (1) y 2-MNQ (2) obtenidos a 275 nm después del desarrollo consecutivo de la placa de cromatografía con las fases móviles 4 y 5 ……………….……… 179 Figura A5. Densitogramas de fluorescencia para la determinación de escopoletina (1) obtenidos a una longitud de onda excitación de 302 nm y con la lectura de la intensidad de fluorescencia emitida con filtro de detección K400 después del desarrollo consecutivo de la placa de cromatografía con las fases móviles 6 y 7 ………………………………………………….……….. 184 Figura A6. Tendencia dosis respuesta observada con los extractos y quercetina en el ensayo de inhibición de la producción de ROS a nivel intracelular. Las barras de error corresponden al error estándar ………..…… 189 Figura A7. Análisis PCA tridimensional para los diferentes parámetros evaluados en los extractos sujetos a estudio ……………………………..…… 191 xv LISTA DE ABREVIATURAS 2-MNQ: 2-metoxi-1,4-naftoquinona. A520nm: Absorbancia a 520 nm a pH 1,0. A’520nm: Absorbancia a 520 nm a pH 4,5. A700nm: Absorbancia a 700 nm a pH 1,0. A’700nm: Absorbancia a 700 nm a pH 4,5. AAPH: Diclorhidrato de 2,2-azobis-2-amidinopropano. AB: Absorbancia promedio del blanco. ABCB: Es el área bajo la curva obtenida para el blanco. ABCC: Área bajo la curva del control. ABCM: Área bajo la curva total obtenidos para las soluciones de prueba de los extractos o para las soluciones de estándar antioxidante. ABCN: Área bajo la curva neta. ABCNE: Área bajo la curva neta obtenida con la solución de prueba de extracto. ABCNT: área bajo la curva neta obtenida con una solución estándar de trolox. ABM: Absorbancia promedio del blanco de muestra. AC: Absorbancia promedio del control. ACAT1: Acetyl-coenzyme A acetyltransferase 1. ADN: Ácido desoxirribonucleico. AGE: Productos finales de glicación avanzada. AhR: Aryl Hydrocarbon Receptor. AKT: Proteína quinasa B. ALK1: Activin receptor-like kinase 1. AM: Absorbancia promedio obtenida con las diluciones de prueba del extracto. AMPK: AMP-activated protein kinase. ANOVA: Análisis de varianza. APP: Proteína precursora amiloide. AR: Absorbancia relativa. ASC: Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD. xvi ASK1: Apoptosis signal-regulating kinase. ATCC: American Type Culture Collection. Aβ: Péptido β-amiloide. Bcl-2: B-cell lymphoma 2. C3GE: Equivalentes de cianidina-3-O-glucósido. CAT: Catalasa. CCL-2: Monocyte chemoattractant protein-1. CDC: Centro de Control de Enfermedades. CD36: Cluster of differentiation 36. CE: Concentración de prueba del extracto. CICUA: Comité Institucional de Cuido y Uso de Animales. CMB: Concentración mínima bactericida. CMI: Concentración mínima inhibitoria. CO2: Dióxido de carbono. CT: Concentración de solución estándar de trolox. DER: Desviación estándar relativa. DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidracilo. DUOX: Oxidasa dual. EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético. EDTAE: Equivalentes de EDTA. ERYCA: Actividad antioxidante celular de eritrocitos. FADH2: Flavín adenín dinucleótido, forma reducida. FC: Intensidad de fluorescencia medida a los pozos control. FIC: Capacidad quelante sobre el ion ferroso. FL-20: Extracto de flores liofilizadas de I. hawkeri (recolección: febrero de 2020). FM: Intensidad de fluorescencia de los pozos de las células tratadas con extractos o quercetina. FR: Fluorescencia relativa. FRAP: Poder antioxidante reductor férrico. xvii GAE: Equivalentes de ácido gálico. GATA4: Transcription factor GATA-4. GPx: Glutatión peroxidasa. H2DCFDA: Diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina. H2O: Agua. H2O2: Peróxido de hidrógeno. HAT: Transferencia de átomos de hidrógeno. HH-20: Extracto de hojas de I. hawkeri secadas al horno a 70 °C (recolección: febrero de 2020). HH-21: Extracto de hojas de I. hawkeri secadas al horno a 70 °C (recolección: febrero de 2021). HIF-1α: Hypoxia-inducible factor 1-alpha. HIFs: Hypoxia-inducible factors. HL-21: Extracto de hojas liofilizadas de I. hawkeri (recolección: febrero de 2021). HO: Heme oxigenasa. HOCl: Ácido hipocloroso. HPLC: Cromatografía líquida de alto desempeño. HPLC-DAD: Cromatografía liquida de alto desempeño acoplado a detector de arreglo de diodos. HPLC-DAD-MS: Cromatografía liquidad de alto desempeño acoplada a detector de arreglo de diodos y espectrómetro de masas. HPTLC: Cromatografía de capa fina de alto desempeño. HS-21: Extracto de hojas de I. hawkeri secadas a la sombra (recolección: febrero de 2021). IAB: Índice de actividad antibacteriana. IC50DPPH: Concentración de antioxidante que inhibe o estabiliza el 50 % del radical DPPH. IC50LPO: Concentración que produce la inhibición del 50 % de la peroxidación lipídica. xviii IL: Interleucina. IROS: Inhibición de la generación de ROS a nivel intracelular. JNK: c-Jun N-terminal kinase. LD: Limite de detección. LDL: Lipoproteínas de baja densidad. LDLR: Receptores de LDL. LEBI: Laboratorio de Ensayos Biológicos. LOX-1: Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1. LPO: Ensayo de inhibición de la peroxidación lipídica. LQ: Limite de cuantificación. MARCO: Macrophage receptor with collagenous structure. MAPKs: Mitogen-activated protein kinases. MEM: Medio esencial mínimo. MHC: Contexto mayor de histocompatibilidad. MPTP: 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina. mPTP: Poro de transición de permeabilidad mitocondrial. mTOR: Mammalian target of rapamycin. NAD+: Nicotianamina adenina dinucleótido, forma oxidada. NADH: Nicotianamina adenina dinucleótido, forma reducida. NADP+: Fosfato de nicotianamina adenina dinucleótido, forma oxidada. NADPH: Fosfato de nicotianamina adenina dinucleótido, forma reducida. NF-κB: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells. NK: Células asesinas naturales. NLRP3: NLR family pyrin domain containing 3. NO•: Radical óxido nítrico. NO2 • : Radical dióxido de nitrógeno. NO3 -: Nitrato. NOX: NADPH oxidasas. NQO1: NAD(P)H: quinona oxidorreductasa. xix NQO2: N-ribosildihidronicotinamida: quinona reductasa 2. Nrf2: Nuclear factor erythroid 2-related factor 2. •OH: Radical hidroxilo. 1O2: Oxígeno singlete. O2: Oxígeno molecular. O2 •-: Radical superóxido. ONOO-: Peroxinitrito. ONOOH: Ácido peroxinitroso. ORAC: Capacidad de absorción de radicales de oxígeno. p38 MAPK: p38 mitogen-activated protein kinases. PAH-20: Extracto de partes áreas de I. hawkeri secadas al horno a 70 °C (recolección: febrero de 2020). PBS: Solución amortiguadora salina de fosfatos. PC: Componente principal. PCA: Análisis de componentes principales. PEH-20: Extracto de plantas enteras de I. hawkeri secadas al horno a 70 °C (recolección: febrero de 2020). PI3K: Phosphoinositide 3-kinase. QE: Equivalentes de quercetina. Raf: rapidly accelerated fibrosarcoma kinase. RAGE: Receptor de AGE REDOX: Reacciones de oxidorreducción. Rf: Coeficiente de retención. RFC: Reactivo de Folin-Ciocalteu. RH-20: Extracto de raíces de I. hawkeri secadas al horno a 70 °C (recolección: febrero de 2020). RNS: Reactive nitrogen species. RO•: Radical alcoxilo. ROO•: Radical peróxilo. xx ROOH: Peróxidos orgánicos. ROS: Reactive oxygen species. RSA: Porcentaje de la actividad barredora del radical DPPH. SCF: Sumatoria de compuestos fenólicos cuantificados mediante ensayos HPTLC. SE. Solución de estándar o estándares. SET: Transferencia de un electrón. SLUG: Neural crest transcription factor Slug. SMAD: Mothers against decapentaplegic homolog. sMaf: Small Maf. SNAIL: Protein snail homolog. SOD: Superóxido dismutasa. SR-AI: Scavenger receptor class A1. SR-BI: Scavenger receptor class B type I. SREC1: Scavenger receptor expressed by endothelial cells 1. SR-PSOX: Scavenger receptor for phosphatidylserine and ox-LDL. TB: Nivel basal de TBARS del homogenizado de hígado de rata. TBARS: Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico. TBHP: Hidroperóxido de tert-butilo. TC: Nivel de TBARS del control al 100 % de producción de TBARS en homogenizado de hígado de rata. TE: Equivalentes de trolox. TFC: Contenido de flavonoides totales. TH-20: Extracto de tallos de I. hawkeri secadas al horno a 70 °C (recolección: febrero de 2020). TLR: Toll-like receptors. TM: Nivel de TBARS obtenidos al tratar el homogenizado de hígado de rata con extracto o quercetina. TMA: Cantidad de antocianinas monoméricas totales. TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa. xxi TPC: Contenido de compuestos fenólicos totales. TWIST: Twist-related protein. TXNIP: Thioredoxin-interacting protein. UCI: Unidades de cuidados intensivos. UFC: Unidades formadoras de colonias. UV: Ultravioleta. VLDL: Lipoproteínas de muy baja densidad. ZEB: Zinc finger E-box-binding homeobox. ε: Constante de absortividad molar. xxii LISTA DE ECUACIONES Ecuación 1. Fórmula para el cálculo de TMA mediante el método colorimétrico de pH diferencial …………………………….……………….. 43 Ecuación 2. Cálculo del área bajo la curva neta de los gráficos de decaimiento de la fluorescencia relativa ……………………….….……………………… 44 Ecuación 3. Fórmula para la determinación del valor ORAC de los extractos 44 Ecuación 4. Fórmula para la determinación del porcentaje de actividad secuestrante del radical DPPH de los extractos ……………………….…….. 46 Ecuación 5. Fórmula para la determinación del porcentaje de inhibición de la producción de TBARS en los homogenizados de hígado de rata sometidos a peroxidación lipídica ……………………………..………………………….. 50 Ecuación 6. Fórmula para la determinación del porcentaje de viabilidad celular de las células Vero expuestas a los extractos o a la quercetina …..…… 53 Ecuación 7. Fórmula para la determinación del porcentaje de inhibición de la generación de ROS (IROS) a nivel intracelular en células Vero ….………… 55 1 1. Introducción: 1.1. Especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS) y el estrés oxidativo: 1.1.1. Principales fuentes de ROS y RNS: Los términos ROS y RNS hacen referencia a especies químicas con átomos oxígeno y nitrógeno, respectivamente, las cuales pueden ser radicales libres o precursoras de este tipo de compuesto. Por su parte, un radical libre corresponde a entidades químicas que se caracterizan por la presencia de orbitales con electrones desapareados lo cual les confiere una alta reactividad química. La alta reactividad química de los radicales libres hace que los mismos puedan tener efectos deletéreos sobre macromoléculas en sistemas biológicos, incluyendo lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y proteínas. Entre los ROS más comunes en sistemas biológicos se encuentran el peróxido de hidrógeno (H2O2), el ácido hipocloroso (HOCl), el oxígeno singlete (1O2), peróxidos orgánicos (ROOH) y los radicales libres anión superóxido (O2 •-), hidroxilo (•OH), alcoxilo (RO•) y peroxilo (ROO•). Por su parte, los RNS más importantes incluyen al peroxinitrito (ONOO-), ácido peroxinitroso (ONOOH) y a los radicales libres óxido nítrico (NO•) y dióxido de nitrógeno (NO2 •) (1-3). Las mitocondrias constituyen el principal sitio de producción de ROS a nivel celular, especialmente de O2 •- y H2O2. La cadena respiratoria es un proceso responsable de la producción de ROS, entre 0,2 % y 2 % de la transferencia de electrones no sigue su ruta normal dirigida a la generación del gradiente de protones que promueve la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) mediante la fosforilación oxidativa, estos electrones reaccionan con oxígeno molecular (O2) dando origen a la producción de O2 •- que por acción de la enzima superóxido dismutasa (SOD) se convierte en H2O2, esta última molécula es transformada a agua por la actividad de las enzimas glutatión peroxidasa (GPx) y catalasa (CAT) (1,4-6). Existen otras fuentes de ROS y RNS, entre las que se encuentran el catabolismo de purinas y los procesos de degradación de D-aminoácidos y ácidos grasos los cuales tienen lugar en los peroxisomas (7). Además, los ROS y RNS son 2 compuestos que actúan como reguladores de la señalización celular e incluso son producidos como parte de la respuesta de células del sistema inmune ante patógenos contra los cuales actúan promoviendo su daño y degradación. Además, la exposición a agentes externos como los xenobióticos, la radiación ultravioleta, la energía ionizante, el humo del cigarrillo y los metales pesados representa un factor promotor de la formación de radicales libres en sistemas biológicos y con ello la posibilidad de desarrollar estrés oxidativo (8). En el cuadro I se resumen los principales factores endógenos generadores de ROS y RNS a nivel celular. Cuadro I. Principales factores generadores de ROS y RNS a nivel celular. Factor generador de ROS o RNS Principales ROS y RNS producidos Referencias Cadena respiratoria O2 •- 1,4,5 Xantina oxidasa O2 •- 1 Deshidrogenasas de 2-oxoácidos O2 •- 1,4 Monoamino oxidasas A y B H2O2 1 Procesos de catabolismo en peroxisomas O2 •- y H2O2 1,9 Óxido nítrico sintasas (NOS) NO• 1,9,10 Reconocimiento de antígenos por el sistema inmune y reacción espontanea entre NO• y O2 •- ONOO- y ONOOH 11-15 Degradación de ONOOH: Espontánea o por acción peroxidasas y superóxido dismutasas dependientes de cobre y zinc NO2 •, •OH y NO3 - 11-15 Reacciones de Fenton y Haber-Weiss mediadas por el hierro liberado por la degradación de la ferritina en lisosomas •OH 1,11,16-18 3 Cuadro I (continuación). Principales factores generadores de ROS y RNS a nivel celular. Factor generador de ROS o RNS Principales ROS y RNS producidos Referencias NADPH oxidasas (NOX) O2 •- 1,19,20 Oxidasas duales (DUOX) H2O2 1,19,20 Monooxigenasas del citocromo P450 O2 •- y H2O2 1,21 Mieloperoxidasas HOCl 22 Cadena de transporte de electrones de lisosomas O2 •- 17 Exposición de la piel a la radiación ultravioleta en presencia de agentes fotosensibilizantes en la piel (porfirina, bilirubina, flavinas, melanina, entre otros) 1O2 23 Lipoxigenasas y ciclooxigenasas O2 •- 1,24,25 Peroxidación lipídica ROOH, ROO• 24,25 Reacciones de ROOH y ROO• con trazas de metales de transición RO• y ROO• 24,25 1.1.2. Sistemas antioxidantes y definición de estrés oxidativo: El organismo presenta una serie de sistemas enzimáticos y de vías de señalización que se activan como respuesta a incrementos en los niveles de ROS y RNS los cuales se enlistan en el cuadro II. Estos contribuyen a la homeostasis ante aumentos en dichas especies prooxidantes. Adicionalmente a los sistemas antioxidantes endógenos, existen factores externos que pueden contribuir a la estabilización de ROS 4 y RNS. Entre ellos se pueden mencionar a la vitamina C, a la vitamina E y a metabolitos secundarios de origen vegetal, como los compuestos fenólicos y los carotenoides, los cuales pueden ser obtenidos a través de la dieta. Dichos compuestos se caracterizan porque pueden reaccionar con los radicales libres fomentando su estabilización por mecanismos como la reducción por transferencia de electrones y de átomos de hidrógeno (8,26,27). Cuadro II. Principales sistemas antioxidantes endógenos. Sistema Mecanismo antioxidante Referencias Superóxido dismutasa (SOD) Convierte a O2 •- en H2O2 y O2. 28,29 Catalasa (CAT) Convierte a H2O2 en O2 y agua (H2O). 28,29 Glutation peroxidasa (GPx) Convierte a H2O2 en O2 y H2O. Reducción de peróxidos orgánicos. 28,29 Glutatión reductasa (GR) Convierte al glutatión oxidado a glutatión reducido, el cual participa como cosustrato en las reacciones catalizadas por GPx. 28,29 Glutarredoxinas Reducen enlaces disulfuro de proteínas. 28,29 Tiorredoxinas Reducen enlaces disulfuro de proteínas. 28,29 Tiorredoxina reductasa Reducen a las tiorredoxinas oxidadas. La forma reducida de las tiorredoxinas es la que reacciona con enlaces disulfuro de proteínas. 28,29 Heme oxigenasas (HO) Median la conversión de los grupos heme libres del citosol a biliverdina, monóxido de carbono, agua y a ion hierro II en su forma libre. Los grupos heme libre pueden participar en reacciones de Fenton y Haber-Weiss productoras de ROS. 28-30 5 Cuadro II (continuación). Principales sistemas antioxidantes endógenos. Sistema Mecanismo antioxidante Referencias Ferritina Capturan iones de hierro limitando su participación en reacciones de Fenton y Haber-Weiss productoras de ROS. 31 NAD(P)H: quinona oxidorreductasa (NQO1) y la N- ribosildihidro- nicotinamida: quinona reductasa 2 (NQO2) Catalizan la conversión de quinonas a hidroquinonas mediante la transferencia de dos electrones sin que haya un radical semiquinona como intermediario, aspecto que las diferencian de otras enzimas, como las NADPH citocromo P450 reductasas o el citocromo b5 reductasa, que reducen quinonas por transferencias consecutivas de un solo electrón, dándose la formación de radicales semiquinona como intermediarios y la producción de ROS. 32 Nuclear factor erythroid 2- related factor 2 (Nrf2) La activación de la proteína Nrf2 por ROS y RNS hace que esta actué como factor de transcripción y promueva la expresión de genes antioxidantes: SOD, HO-1, NQO1, GPx, GR, tiorredoxina, tiorredoxina peroxidasa, tiorredoxina reductasa, ferritina y glutamato cisteína ligasa. 11,33-38 Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) La activación de la proteína AhR hace que esta actué como factor de transcripción y promueva la expresión de las proteínas Nrf2, NQO1 y enzimas del grupo del citocromo P450. El metabolismo oxidativo de enzimas del grupo del citocromo P450 produce ROS los cuales como mecanismo de retrocontrol activan la vía de la proteína Nrf2. 38,39 6 Por otra parte, cuando la actividad de las defensas antioxidantes endógenas y el aporte nutricional de sustancias con capacidad antioxidante no permiten mantener la homeostasis ante un incremento en la generación de ROS y RNS, se establece una condición conocida como estrés oxidativo. Esta condición puede deberse a la exposición a factores externos, o bien, puede presentarse como una consecuencia de procesos patológicos. Los niveles elevados de ROS y RNS tienen efectos deletéreos sobre la integridad de macromoléculas, lo cual a su vez puede tener impactos negativos para la salud, al punto de que el estrés oxidativo se relaciona con la incidencia y/o progresión de múltiples patologías entre las que encuentran: cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, arteriosclerosis, falla cardiaca, diabetes, procesos inflamatorios, entre otros (8,40). 1.1.3. Estrés oxidativo y su relación con patologías: El estrés oxidativo puede ser un factor causante de inflamación. En macrófagos se ha observado que un incremento en la producción de ROS por parte de las mitocondrias promueve que las proteínas NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC) y procaspasa 1 sean reclutadas por la membrana del retículo endoplasmático asociada a mitocondrias. A continuación, se da la asociación entre dichas proteínas, lo que da origen al inflamasoma NLRP3, en el cual la procaspasa 1 se convierte a caspasa 1. Esta última proteína tiene la actividad proteolítica del inflamasoma NLRP3 que convierte a las prointerleucinas 1β y 18 a su forma activa, IL-1β e IL-18. Ambas proteínas corresponden a conocidas citoquinas proinflamatorias (41,42). La manera exacta de como los ROS promueven la asociación de proteínas para la conformación del inflamasoma NLRP3 es un tema de debate, se ha propuesto que los ROS pueden activar a proteínas como rapidly accelerated fibrosarcoma kinase (Raf), Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) y phosphoinositide 3-kinase (PI3K), cuyas vías de señalización estimulan el ensamblaje del complejo inflamasoma NLRP3. También se ha planteado que un incremento de especies prooxidantes a nivel intracelular estimula la disociación del complejo de la tiorredoxina 1 con la proteína 7 thioredoxin-interacting protein (TXNIP), esta última en su forma libre puede asociarse con la proteína NLRP3, evento que promueve la integración del inflamasoma NLRP3 (42). La acumulación excesiva de hierro en el tejido hepático, como la que puede presentarse en hemocromatosis hereditarias o secundarias, favorece el desarrollo de lesiones oxidativas vinculadas con la producción de ROS a través de reacciones de Fenton y Haber-Weiss. En células de Kuffer, la elevación en la producción de ROS puede promover la activación de la proteína nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) y la consecuente expresión de citoquinas inflamatorias, entre las que se encuentran IL-6, IL-1β y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Además, el exceso de hierro a nivel hepático es un factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma hepatocelular (43). Por otra parte, en modelos in vivo con ratones diabéticos, se ha observado que las dietas con hierro excesivo fomentan estrés oxidativo y la activación del inflamasoma NLRP3 a nivel hepático (44). Los ROS y RNS son factores que pueden comprometer la integridad química del ácido desoxirribonucleico (ADN), sobre el cual pueden desencadenar reacciones de hidrólisis de bases nitrogenadas, oxidación de bases nitrogenadas, entrecruzamientos entre bases nitrogenadas y rotura de hebras de ADN (45). Las modificaciones del ADN producidas por reacciones oxidativas y/o radicalarias pueden promover mutagénesis, lo cual puede resultar en la transformación de células normales a células de cáncer (11,46). Inclusive, productos secundarios del daño oxidativo del ADN, poliaminas, aminoácidos, carbohidratos y lípidos, como las bases de propenal, el metilglioxal, la acroleína y el malondialdehído, pueden fungir como inductores de mutaciones al participar en reacciones de alquilación de bases nitrogenadas. Estas reacciones pueden tener como consecuencia la inducción de carcinogénesis (47-52). Con respecto a la producción de ROS y RNS durante la progresión del cáncer y el desarrollo de metástasis, existe dualidad en sus efectos. Por ejemplo, un aumento de la producción de ROS por parte del sistema inmune puede tener efectos citotóxicos sobre las células de cáncer durante la progresión de la enfermedad, además, en algunos 8 tipos de cáncer, la exposición de células neoplásicas a niveles elevados de oxígeno puede inducir apoptosis (48). Inclusive, hay terapias farmacológicas y otras como la radioterapia que actúan mediante la inducción de estrés oxidativo en las células de cáncer (53). Además, hay resultados de estudios en modelos animales de progresión del cáncer que señalan que la administración de antioxidantes puede favorecer el desarrollo de metástasis (54). Sin embargo, las especies oxidantes también pueden favorecer la progresión del cáncer. Se han planteado diferentes mecanismos que pueden explicar este fenómeno. Células del estroma asociado al tumor pueden producir citoquinas, factores de crecimiento y ROS que estimulan a las células de cáncer en fases iniciales de transformación (células precancerosas). Las citoquinas y factores de crecimiento, al ser reconocidos por sus receptores, pueden desencadenar mecanismos de transducción de señales que conducen a un aumento en la expresión de enzimas NOX, las cuales son reconocidas por su actividad generadora de ROS (48). Los ROS producidas en el interior de las células precancerosas o provenientes de macrófagos asociados al tumor, pueden activar vías y proteínas de señalización que incluyen a Raf/MAPK, PI3K/proteína quinasa B (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR), mothers against decapentaplegic homolog (SMAD), NF-κB e hypoxia-inducible factors (HIFs). Una de las consecuencias de activar dichos procesos de señalización es la expresión de genes que están implicados en la transición de célula epitelial a mesenquimal, evento que promueve la transición de una célula relativamente diferenciada a otra con un fenotipo mesenquimal con mayor potencial de migración, invasividad y de evasión de la apoptosis. Entre dichos genes se pueden mencionar a: Protein snail homolog (SNAIL), Twist-related protein (TWIST), Neural crest transcription factor Slug (SLUG) y Zinc finger E-box-binding homeobox (ZEB) (48,55,56) Por otra parte, las células supresoras derivadas de línea mieloide, las cuales forman parte del estroma asociado al tumor, pueden producir ONOO- el cual puede nitrar residuos de tirosina del receptor CD8 de linfocitos T citotóxicos. Esto evita el 9 reconocimiento de antígenos presentados en el contexto mayor de histocompatibilidad (MHC) por parte de los linfocitos T, lo que reduce su actividad citotóxica sobre las células de cáncer. El ONOO- también puede nitrar e inactivar a quimiocinas como a monocyte chemoattractant protein-1 (CCL-2), reduciendo con ello la migración de linfocitos T y células asesinas naturales (NK) hacia los focos de crecimiento tumoral (48). Por la relevancia de los ROS y RNS como un factor que contribuye a la progresión del cáncer, se han realizado investigaciones para definir si agentes antioxidantes pueden contribuir a la eficacia de los tratamientos contra dicha enfermedad. Existen estudios en animales que demuestran que la combinación de fármacos antineoplásicos con agentes antioxidantes puede ser más eficaz que el tratamiento en el que solo se administran los fármacos antineoplásicos (57). Por lo tanto, se puede decir que los antioxidantes pueden fomentar o mitigar la progresión del cáncer, lo cual posiblemente este determinado por los eventos celulares y las características moleculares específicas de los diferentes tipos de célula de cáncer, de modo que no se puede establecer una generalización al respecto. En condiciones de hiperglicemia, como la experimentada en la diabetes mellitus, puede tener lugar la autooxidación de la glucosa en la cual pueden producirse ROS. Además, el exceso de glucosa y de lípidos (como en el caso de las dislipidemias) favorece una mayor disponibilidad de NADH y FADH2 a nivel celular en comparación con condiciones fisiológicas normales. En la mitocondria, el exceso de estos compuestos contribuye a la fuga de electrones a O2 a nivel de la cadena de transporte de electrones dando origen a la producción de ROS, particularmente O2 •-. El incremento de los niveles de ROS activa a la proteína AMP-activated protein kinase (AMPK), esta proteína puede inhibir a mTOR, lo que tiene como consecuencia una reducción en la producción de insulina en las células pancreáticas β. Además, los ROS pueden activar al inflamasoma NLRP3 a través de una mayor expresión de TXNIP, produciendo daño en el tejido pancreático. Incluso, la elevación de ROS puede modular positivamente a la proteína apoptosis signal-regulating kinase (ASK1), que 10 por fosforilación activa las vías de p38 MAPK y c-Jun N-terminal kinase (JNK), capaces de inhibir a proteínas B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) antiapoptóticas y de activar proteínas Bcl-2 proapoptóticas, dando lugar al compromiso de la integridad membrana mitocondrial externa y la consecuente activación de la apoptosis. Estos cambios pueden fomentar una pérdida de las células pancreáticas β, lo cual contribuye a la progresión de la diabetes mellitus (58-60). Por otra parte, el glioxal, el metilglioxal y la 3-desoxiglucosona, producidos por la autooxidación de la glucosa en condiciones de hiperglicemia, pueden formar productos finales de glicación avanzada (AGE), los cuales consisten en la modificación covalente de proteínas y lípidos con compromiso en sus funciones biológicas. Este fenómeno está relacionado con el desarrollo de neuropatía, retinopatía y nefropatía durante la progresión de la diabetes mellitus (58,61). En circunstancias de niveles plasmáticos elevados de lipoproteínas que contienen apoproteína B, como las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), estas sustancias son captadas por las células endoteliales debido a su reconocimiento por los receptores de LDL (LDLR) (en barrera hematoencefálica) o por la proteína scavenger receptor class B type I (SR-BI), posteriormente, los receptores LDLR o las proteínas caveolina 1 y activin receptor-like kinase 1 (ALK1) median la transcitosis de las lipoproteínas a lo interno de la túnica intima de vasos sanguíneos (62). En el espacio subendotelial, las lipoproteínas pueden ser retenidas por su afinidad por proteoglicanos de la matriz extracelular. Los ROS y RNS producidos por la presencia de trazas de iones de hierro II, por la actividad de enzimas oxidativas, como lipoxigenasas y mieloperoxidasas, o por células de endotelio, musculo liso y del sistema inmune, promueven la oxidación de las lipoproteínas, las cuales pueden agregarse y cristalizar (63). Las lipoproteínas oxidadas son captadas por macrófagos a través de su reconocimiento por diversas proteínas, entre las que se encuentran scavenger receptor class A1 (SR-A1), macrophage receptor with collagenous structure (MARCO), cluster of differentiation 36 (CD36), SR-B1, lectin-like oxidized low- 11 density lipoprotein receptor-1 (LOX-1), Scavenger receptor expressed by endothelial cells 1 (SREC1) y scavenger receptor for phosphatidylserine and ox-LDL (SR-PSOX) (64,65). Los macrófagos procesan a las lipoproteínas que han captado en los lisosomas, formando ácidos grasos y colesterol libres. En el retículo endoplásmico, el colesterol libre es reesterificado por la acetyl-coenzyme A: acetyltransferase 1 (ACAT1), sin embargo, el exceso de colesterol provoca que este proceso no se complete, quedando colesterol remanente no esterificado, el cual cristaliza dando origen a las “células espumosas” que pueden entrar en necrosis producto del colesterol no esterificado. Por otra parte, los macrófagos producen citoquinas como TNF-α, IL‑1β e IL‑18 debido al reconocimiento de las lipoproteínas oxidadas por parte de Toll-like receptors (TLRs) y la activación del inflamasoma NLRP3. Adicionalmente, las citoquinas pueden promover el reclutamiento de otras células de la inmunidad innata, como neutrófilos, células asesinas naturales (NK) y mastocitos (64,66). La inflamación crónica y el aclaramiento deficiente de las células necróticas dan origen a la placa arteriosclerótica. Además, las lipoproteínas alteradas pueden ser presentadas por células presentadoras de antígenos a linfocitos CD4, lo cual estimula a células de la inmunidad adquirida. Las células inmunes reclutadas en la placa arterioesclerótica secretan proteasas que comprometen la integridad local de la matriz extracelular y del colágeno de la túnica íntima, esto sumado al crecimiento de los depósitos lipídicos en forma de células espumosas, puede favorecer la ruptura de vasos sanguíneos, lo cual puede desencadenar el desarrollo de tromboembolismo, factor promotor de accidentes cerebrovasculares y de infartos agudos al miocardio (64,66). Otra enfermedad cardiovascular en la que el estrés oxidativo tiene injerencia es la falla cardiaca. Los niveles excesivos de ROS y RNS en los cardiomiocitos puede inducir su apoptosis a través de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP). Modelos knockout en ratones demuestran que la no expresión de SOD favorece la degeneración de los cardiomiocitos y la dilatación ventricular. Por otra parte, en ratones transgénicos con sobreexpresión de GPx se ha observado que la 12 inducción de infartos al miocardio promueve una menor dilatación del ventrículo izquierdo, un menor decaimiento de la presión diastólica y una menor incidencia de hipertrofia cardiaca, apoptosis y fibrosis intersticial en comparación con ratones normales o de tipo silvestre (67,68). El estrés oxidativo también está relacionado con la cardiotoxicidad y desarrollo de falla cardiaca por exposición a xenobióticos prooxidantes como la doxorrubicina. La producción de ROS inducida con doxorrubicina puede promover la peroxidación de lípidos de la membrana de cardiomiocitos, comprometiendo a su vez la actividad de las proteínas de membrana. La actividad de la proteína transcription factor GATA-4 (GATA4) se ve disminuida en condiciones de estrés oxidativo inducido con doxorrubicina, lo cual se asocia al deterioramiento de las miofibrillas y una reducción de la fuerza de contracción del musculo cardiaco. Además, las especies oxidantes pueden promover la apoptosis a través de la activación de la proteína p53 y de las vías de las proteínas p38 MAPK y JNK (67,69). El estrés oxidativo está involucrado en la progresión de patologías neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. El péptido β-amiloide (Aβ) puede acumularse en las mitocondrias mediante la acción de la translocasa de la membrana externa o del receptor de AGE (RAGE), sitio donde puede comprometer el funcionamiento de la cadena de transporte de electrones y con ello inducir la producción de ROS. Además, la presencia de Aβ a nivel mitocondrial se relaciona con una disminución en la actividad de SOD. Por otro parte, en los depósitos o placas de Aβ se ha determinado la presencia de iones de hierro y cobre los cuales pueden participar en reacciones de Fenton y Haber-Weiss generadoras de ROS. Adicionalmente, las células gliales pueden reconocer a Aβ y desencadenar una reacción inflamatoria con la producción de ROS y RNS. La inflamación puede tornarse más severa debido a la capacidad de los ROS y RNS de activar al inflamasoma NLRP3 (70,71). Se ha observado que bajo condiciones de estrés oxidativo se da una mayor expresión de las enzimas β-secretasa y γ-secretasa, cuya actividad proteolítica sobre la 13 proteína precursora amiloide (APP) genera Aβ. Por otro lado, los ROS pueden activar a Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1α), el cual es un factor de transcripción que promueve la expresión de γ-secretasa. Tanto Aβ como los ROS y RNS son factores con la capacidad de inducir apoptosis a nivel neuronal (71-73). El estrés oxidativo también se ha relacionado con el desarrollo y progresión de la enfermedad de Parkinson. La dopamina es una molécula inestable que puede autooxidarse formando una quinona y ROS. Este proceso puede ser facilitado por la presencia de trazas de metales de transición y la acción de enzimas como la tirosinasa. Esto provoca que las neuronas dopaminérgicas, como las presentes en la substantia nigra, sean más susceptible al desarrollo de estrés oxidativo con la posibilidad de que el daño inducido por las especies oxidantes promueva la apoptosis de estas células. Además, las neuronas que presentan estrés oxidativo pueden secretar productos del daño oxidativo de proteínas y lípidos, los cuales pueden estimular a la microglía. Estas células como respuesta pueden secretar NO•, lo cual puede fomentar mayor estrés oxidativo y neurotoxicidad (74,75). El estrés oxidativo promueve la peroxidación lípidos de las membranas de las neuronas, entre los productos de este proceso se encuentran el malondialdehído y el 4- hidroxil-2-nonenal, los cuales pueden dañar la integridad de proteínas y del ADN, promoviendo con ello la apoptosis de las neuronas. La implicación de estos eventos en la progresión de la enfermedad de Parkinson ha sido propuesta con base a la observación post mortem de una mayor cantidad de productos de la peroxidación lipídica en la substantia nigra de pacientes con enfermedad de Parkinson. Además, se ha planteado que la disfunción mitocondrial y la consecuente producción de ROS están relacionados con el desarrollo de la enfermedad de Parkinson. Esto se ha basado en el parkinsonismo observado en animales experimentales y en pacientes expuestos a 1- metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), una toxina capaz de inhibir al complejo mitocondrial I (74,76,77). 14 1.2. Propiedades antioxidantes de los compuestos fenólicos de origen vegetal: Los compuestos fenólicos de origen vegetal son un conjunto muy heterogéneo de metabolitos secundarios, tanto por sus diferencias estructurales como por su origen biosintético. En la figura 1 se presentan ejemplos de compuestos pertenecientes a las diferentes categorías estructurales que presentan los compuestos fenólicos de origen vegetal. Adicionalmente a los compuestos no glicosídicos mostrados en la figura 1, en la naturaleza también es posible encontrar compuestos fenólicos con unidades de azúcar en su estructura formando glicósidos. Los compuestos fenólicos se pueden extraer de material vegetal principalmente mediante el uso de solventes orgánicos polares, como el metanol, etanol, acetona y acetato de etilo (26). Figura 1. Estructura química de ejemplos de los principales tipos de compuestos fenólicos de origen vegetal. En itálica se indica el nombre de la subclasificación. 15 Figura 1 (continuación). Estructura química de ejemplos de los principales tipos de compuestos fenólicos de origen vegetal. En itálica se indica el nombre de la subclasificación. 16 Figura 1 (continuación). Estructura química de ejemplos de los principales tipos de compuestos fenólicos de origen vegetal. En itálica se indica el nombre de la subclasificación. 17 Figura 1 (continuación). Estructura química de ejemplos de los principales tipos de compuestos fenólicos de origen vegetal. En itálica se indica el nombre de la subclasificación. 18 Figura 1 (continuación). Estructura química de ejemplos de los principales tipos de compuestos fenólicos de origen vegetal. Los compuestos fenólicos se caracterizan porque pueden presentar actividad antioxidante a través de diferentes mecanismos químicos y biológicos (activación de vías de señalización antioxidantes). Entre los mecanismos químicos de actividad antioxidante de los compuestos fenólicos, se encuentran la transferencia de átomos de hidrógeno (HAT), la transferencia de un electrón (SET) y la actividad quelante sobre iones de metales de transición. En la figura 2, se ilustran estos mecanismos de actividad antioxidante (26,78-79). Figura 2. Esquema de los mecanismos químicos de actividad antioxidante de los compuestos fenólicos. A. Mecanismo HAT, B. Mecanismo SET, C. Mecanismo por acción quelante. R•: radical libre. 19 En el mecanismo HAT, los compuestos fenólicos transfieren un átomo de hidrógeno a los radicales libres, lo cual convierte a estos últimos en una especie más estable debido a la formación de un enlace simple por el aporte de un electrón del átomo de hidrógeno y el electrón desapareado del radical. En el mecanismo SET, el compuesto fenólico transfiere directamente un electrón, reduciendo al radical a un anión. Tanto en el mecanismo HAT como SET se da la formación de radicales fenilos, los cuales, gracias a su resonancia, son más estables en comparación con radicales libres correspondientes a ROS y RNS. Adicionalmente, los radicales fenilos pueden ser estabilizados a través de reacciones de acople oxidativo o radicalario en las cuales se forman compuestos fenólicos diméricos. En el caso de la actividad quelante, su relevancia antioxidante radica en el hecho de que los complejos formados entre iones de metales de transición, como el ion hierro II o ion ferroso, con los compuestos fenólicos limitan la disponibilidad de los primeros, reduciendo la posibilidad de que participen en reacciones de Fenton y Haber-Weiss generadoras de ROS (26,78-80). Con respecto a los mecanismos biológicos, diferentes compuestos fenólicos pueden activar vías de señalización relevantes que median la expresión de factores antioxidantes endógenos. Por ejemplo, los compuestos quercetina, kaempferol, rutina, isoquercetina, escopoletina y 2-metoxi-1,4-naftoquinona (2-MNQ) pueden activar la vía de la proteína Nrf2 (34,81-84), mientras que los compuestos quercetina y lawsona son capaces de modular positivamente a la vía de la proteína AhR (85-87). 1.3. Infecciones bacterianas y la necesidad de nuevos agentes antibacterianos: Los fármacos antibacterianos han tenido una alta relevancia para el progreso de la medicina, haciendo posible el tratamiento de enfermedades infecciosas y minimizando los riesgos de desarrollo de infecciones producto de intervenciones quirúrgicas, traumatismos y cuadros de inmunosupresión relacionados a trastornos del sistema inmune o como consecuencia de tratamientos para evitar el rechazo de órganos trasplantados y de terapias contra el cáncer (88,89). 20 Producto de las malas prácticas en el uso de los antibióticos durante décadas, actualmente se observa un incremento de cepas bacterianas con factores de resistencia o con características de tolerancia o persistencia ante el tratamiento con antibióticos. El uso inadecuado de los antibióticos ha provocado que ejerzan un papel como factores de presión selectiva que fomenta la proliferación de aquellas poblaciones bacterianas con características que facilitan su sobrevivencia (89-92). Las infecciones bacterianas son un problema creciente para la salud pública. Estas pueden complicar la salud de los pacientes hospitalizados, haciendo más difícil su recuperación, lo que en primera instancia afecta la salud de los pacientes, pero a su vez implica un mayor costo para los sistemas de atención sanitaria (93). Un ejemplo reciente de esto es el incremento del tiempo de recuperación y el mayor riesgo de muerte debido a infecciones bacterianas secundarias observado en pacientes hospitalizados con enfermedad por coronavirus (COVID-19) (94,95). Sin embargo, las infecciones debidas a bacterias patógenas con multirresistencia a los antibióticos no se limitan al contexto hospitalario, siendo posible su propagación a nivel comunitario con una alta tasa de mortalidad en ambos casos (96). Incluso, se ha proyectado que para el año 2050 se puedan dar alrededor de 10 millones de muertes anuales debidas a infecciones bacterianas (97). Dado el impacto de las infecciones bacterianas en la salud pública, la Organización Mundial de la Salud ha definido una serie de microorganismos cuyas infecciones requieren el desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos de manera prioritaria, dado la creciente ineficacia de los agentes terapéuticos disponibles actualmente a nivel clínico. Entre dichos microorganismos se encuentran Pseudomonas aeruginosa y enterobacterias resistentes a β-láctamicos portadoras de carbapenemesas, contra las cuales se considera crítico el desarrollo de nuevos antimicrobianos. En el caso de Salmonella spp. resistente a fluoroquinolonas y Staphylococcus aureus resistente a meticilina o a vancomicina, estas bacterias se reconocen como de prioridad alta para el descubrimiento de antibacterianos que sean capaces de contralar sus infecciones (98). 21 De acuerdo con estadísticas de los Estados Unidos, P. aeruginosa presenta una prevalencia de entre 7,1 % y 7,3 % de las infecciones adquiridas en centros de salud, siendo la neumonía la principal forma de infección por este microorganismo. Con respecto a las infecciones respiratorias adquiridas en unidades de cuidados intensivos (UCI), P. aeruginosa presenta una prevalencia del 23 %. El principal factor que promueve este tipo de infecciones en pacientes de UCI son los dispositivos de ventilación mecánica. Se estima que la mortalidad asociada a estas infecciones es de entre el 32 % y 44 %. P. aeruginosa también es uno de los principales patógenos responsables de infecciones del tracto urinario asociadas al uso de catéteres, se estima que un 10 % de los casos de infección del tracto urinario en pacientes hospitalizados se debe a P. aeruginosa. Según el Centro de Control de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC), P. aeruginosa es responsable del 5,7 % de las infecciones en sitios quirúrgicos. También se ha determinado que P. aeruginosa constituye al microorganismo con mayor prevalencia en infecciones de lesiones debidas a quemaduras. Además, esta bacteria es una causa predominante de las complicaciones asociadas al padecimiento de fibrosis quística, entre las que se encuentran infecciones respiratorias crónicas y bronquiectasias. La septicemia por P. aeruginosa presenta una tasa de mortalidad estimada de entre el 43,3 % y el 58,8 % de los casos (99). P. aeruginosa puede presentar factores de resistencia a los antibióticos, como bombas de eflujo, carbapenemasas, β-lactamasas de espectro extendido y enzimas de modificación de aminoglicósidos . Además, este patógeno puede producir biopelículas, las cuales están constituidas por células bacterianas agregadas e inmersas en una matriz extracelular de exopolisacáridos, proteínas, metabolitos y ADN extracelular que limita el contacto entre las bacterias y los antibióticos. Como consecuencia, las probabilidades de sobrevivencia del microorganismo aumentan a pesar de la presencia de antibióticos en su entorno, incluso, para ello no es necesario la expresión de factores de resistencia específicos como los mencionados anteriormente (100). En Estados Unidos se ha determinado que el principal tipo de infección ocasionada por Escherichia coli en pacientes atendidos a nivel hospitalario 22 corresponde a infecciones del tracto urinario (66 %) seguido por bacteriemia (22 %) (101). Los casos de bacteriemia por E. coli suelen estar asociados a infecciones del tracto urinario en un 53 % de los casos y presentan un porcentaje de mortalidad del 12 % (102). De manera similar a P. aeruginosa y a otras enterobacterias, E. coli puede expresar el mismo tipo de factores de resistencia a los antibióticos (103). Las enzimas metalo-β-lactamasas de Nueva Delhi se encuentran entre las carbapenemasas halladas con mayor frecuencia en cepas de E. coli con resistencia a fármacos β-lactámicos (104). Vale la pena destacar que en el año 2019 E. coli fue el patógeno de mayor prevalencia entre los casos de mortalidad debida a infecciones por bacterias resistentes a los antibióticos (97). Klebsiella pneumoniae corresponde a otra enterobacteria de alta relevancia epidemiológica, sobre todo por la alta mortalidad debida a bacteriemia e infecciones del tracto urinario en pacientes de UCI o que han recibido trasplantes de órganos. Se estima que la mortalidad es de alrededor del 42 % en el caso de infecciones por cepas portadoras de carbapenemasas y del 21 % cuando las cepas son sensibles a carbapenemos (105). Según estadísticas de Estados Unidos, se estima que K. pneumoniae es responsable de cerca del 10 % de las infecciones nosocomiales, la tasa de mortalidad por neumonía adquirida a nivel intrahospitalario debida a este patógeno se estima en un 50 % (106). En el caso de Salmonella enterica serovar Typhimurium, este patógeno suele producir infecciones a nivel gastrointestinal debidas a la ingesta de alimentos contaminados, que en la mayoría de los casos corresponden a cuadros de diarrea autolimitante. Esta serovariedad es responsable de alrededor del 12 % de las infecciones debidas a Salmonella a nivel mundial, sin embargo, en África y Norteamérica puede alcanzar una prevalencia del 25 % y 29 %, respectivamente. La salmonelosis por serovariedades no Typhi representa la principal causa de muerte debida a infecciones adquiridas a través del consumo de alimentos contaminados en los Estados Unidos, representando alrededor del 39 % de dichas muertes (107). Además, en países en vías de desarrollo, principalmente en África, se ha observado 23 aumentos en la incidencia de septicemia por salmonela no Typhi con una alta tasa de mortalidad (107,108). S. aureus es un patógeno Gram-positivo que puede participar en infecciones en múltiples sitios anatómicos, entre las infecciones más comunes que puede provocar se encuentran infecciones del tracto respiratorio (tanto inferior como superior), infecciones de piel y tejidos blandos y endocarditis. La bacteriemia es una complicación que se presenta con mayor incidencia en el caso infecciones de piel y tejidos blandos, entre el 9,4 al 34 % de los casos de bacteriemia por S. aureus a nivel mundial se derivan de este tipo de infección. De acuerdo con los resultados de diferentes estudios epidemiológicos llevados a cabo en distintos países, la bacteriemia por S. aureus presenta una incidencia que varía entre 2,6 y 65 casos por cada 100 000 habitantes (109). El porcentaje mortalidad estimado para este tipo de cuadro infeccioso es de entre el 10 % y el 30 % (110). Uno de los factores que promueve mayor mortalidad por bacteriemia por S. aureus es la resistencia a los antibióticos, siendo principalmente relevantes las cepas con resistencia a meticilina y a vancomicina (111,112). Además, el desarrollo de biopelículas constituye otro elemento que complica el tratamiento de las infecciones por S. aureus (113,114). Otros microorganismos patógenos que han ganado relevancia debido al impacto de sus infecciones son Staphylococcus epidermidis y Enterococcus faecalis. En el caso de S. epidermidis, este microorganismo es una causa común de infecciones intrahospitalarias del torrente sanguíneo asociadas con el uso de catéteres e implantes ortopédicos, así como endocarditis asociada a válvulas cardiacas protésicas y marcapasos (115,116). De acuerdo con un estudio retrospectivo observacional llevado a cabo en Albania, el 22 % de las infecciones asociadas a catéteres se deben a S. epidermidis, siendo el principal agente etiológico de dichas infecciones (117). E. faecalis corresponde a un microorganismo importante debido a la incidencia de infecciones nosocomiales relacionadas principalmente a procedimientos invasivos como la colocación de catéteres. Entre las infecciones que provoca este patógeno se encuentran septicemia, endocarditis, infecciones intraabdominales e 24 infecciones urinarias (118,119). De acuerdo con un estudio de casos y controles llevado a cabo en Detroit Medical Center de la ciudad de Michigan, el porcentaje de mortalidad en pacientes hospitalizados con bacteriemia por E. faecalis es de 9,8 % y 7,4 %, en casos de cepas resistentes y no resistentes a vancomicina, respectivamente (120). Actualmente es imperativo el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos para el tratamiento de infecciones producidas por microorganismos resistentes a los medicamentos disponibles para uso clínico (96,121,122). Aspecto que gana relevancia si se considera que la velocidad con la que se desarrollan nuevos fármacos antibacterianos es inadecuada dada la rapidez del proceso de desarrollo de resistencia a los antibióticos por parte de microorganismos infecciosos (122,123). Esto puede ser explicado por el hecho de que el desarrollo de fármacos antibacterianos seguros y eficaces es un proceso lento debido a la necesidad de que estos demuestren un amplio espectro de actividad sobre bacterias patógenas relevantes desde el punto de vista epidemiológico, así como una baja toxicidad para el ser humano (124). El descenso en la eficiencia de las terapias antibacterianas actuales y la escasez de nuevos tipos de moléculas capaces de sustituir o complementar sus terapias, son factores que han promovido un mayor impulso de la investigación para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos. Inclusive, esta línea de investigación se considera como uno de los principales retos para las disciplinas involucradas en el desarrollo de nuevos fármacos durante el presente siglo (125). En el cuadro III, se presenta un resumen de las principales infecciones provocadas por las especies de bacterias patógenas sobre las cuales se sometió a prueba la actividad antibacteriana de los extractos I. hawkeri en el presente estudio. Los antecedentes aportados anteriormente demuestran que es relevante el proceder con la investigación para el descubrimiento de posibles fuentes de moléculas bioactivas que sean útiles para el desarrollo de fármacos para el tratamiento de infecciones debidas a dichos microorganismos. 25 Cuadro III. Principales infecciones provocadas por las especies de bacterias patógenas sobre las que se evalúo la actividad antibacteriana de los extractos de I. hawkeri. Especie bacteriana Principales infecciones Referencias Enterococcus faecalis Infecciones del tracto urinario, infecciones intraabdominales, endocarditis, infecciones de heridas quirúrgicas, bacteriemia. 118,119,126 Escherichia coli Diarrea aguda o crónica, diarrea enterohemorrágica, infecciones del tracto urinario, meningitis, bacteriemia. 127 Klebsiella pneumoniae Neumonía, infecciones del tracto urinario, infecciones de heridas, meningitis, bacteriemia. 128-130 Pseudomonas aeruginosa Neumonía, infecciones del tracto urinario, infecciones de heridas quirúrgicas, bacteriemia. 99 Salmonella enterica serovar Typhimurium Diarrea. 131 Staphylococcus aureus Infecciones del tracto respiratorio superior, neumonía, endocarditis, infecciones de piel y tejidos blandos, infecciones osteoarticulares, meningitis, bacteriemia. 109,132-135 Staphylococcus epidermidis Endocarditis, infecciones de heridas quirúrgicas, bacteriemia. 115,136 26 1.4. Las plantas como fuente de moléculas antibacterianas: Existen varias estrategias utilizadas para el descubrimiento y desarrollo de nuevos antibacterianos, entre ellas se encuentra la modificación estructural fármacos aprobados (137). Sin embargo, los productos naturales son la fuente más importante de moléculas con actividad antimicrobiana, superando en número a los de origen completamente sintético (138). Alrededor de un 65 % de los fármacos aprobados como antibacterianos son productos naturales o derivados semisintéticos de estos (139). Los productos naturales más relevantes en el desarrollo de agentes antibacterianos han sido los metabolitos secundarios sintetizados por bacterias y microorganismos fúngicos (137,140,141). El mejor perfil de actividad de los productos naturales sobre las sustancias sintéticas puede estar relacionado con que estas últimas pueden tener limitaciones para permear las membranas bacterianas, mientras las moléculas bioactivas de origen natural corresponden a compuestos evolutivamente seleccionados para permear las membranas de los microorganismos (138). El aislamiento y purificación de compuestos naturales activos contra microorganismos puede tener obstáculos como una baja producción por parte de los organismos que los sintetizan, el riesgo de que estos pierdan la capacidad de sintetizarlos, la inestabilidad química y una baja eficacia clínica (137). Sin embargo, esta última limitante podría solucionarse a través de la modificación de su estructura química para producir moléculas con un mejor perfil actividad y de espectro antibacteriano (139). Considerando la importancia de desarrollar nuevos agentes antibacterianos por la relevancia que ha ganado la resistencia a los antibióticos, se ha considerado la posibilidad de explorar otras fuentes naturales de moléculas bioactivas alternativas a los microorganismos, los cuales han sido el origen más común de agentes antibacterianos. Entre estas fuentes se han considerado las plantas como un recurso que puede ser explorado (142-144). Inclusive, se ha planteado la posibilidad de que las moléculas derivadas de plantas puedan actuar en sinergia con los fármacos 27 antimicrobianos, de modo que bacterias resistentes a estos puedan ser nuevamente susceptibles (144,145). Entre los productos naturales derivados de plantas, los compuestos fenólicos han sido reconocidos como metabolitos con capacidad inhibir la proliferación bacteriana a través de diversos mecanismos. Los flavonoides, como el galato de epigalocatequina, y los taninos pueden unirse al peptidoglicano y comprometer la integridad de la pared celular. Se ha planteado que las antocianinas se pueden asociar con alta afinidad con los lipopolisacáridos de la membrana externa de bacterias Gram- negativas, lo cual reduce la posibilidad de que estas colonicen nuevos tejidos al limitar la adhesión de las bacterias con las células del huésped. Los flavonoides, lignanos, ácidos fenólicos y monoterpenos fenólicos pueden unirse a la membrana celular bacteriana alterando su integridad y haciéndola más permeable (146,147). El metabolismo bacteriano de compuestos fenólicos como el ácido gálico, el ácido rosmarínico, la quercetina, la epigalocatequina y el galato de epigalocatequina puede generar H2O2 como subproducto, lo cual puede inducir muerte por estrés oxidativo en las células bacterianas. Además, los compuestos fenólicos pueden inhibir enzimas bacterianas, como es el caso de la inhibición de la dihidrofolato reductasa por parte del galato de epigalocatequina y de la ADN girasa por flavonoides como la quercetina. Flavonas, como la miricetina, pueden inhibir a las enzimas helicasas. A nivel intracelular, los ácidos fenólicos pueden inducir reducciones del pH lo cual puede promover la desnaturalización de proteínas microbianas. El ácido p-cumárico puede unirse al ADN bacteriano induciendo cambios en su organización estructural con los que se compromete el metabolismo de ácido nucleicos. Los taninos pueden actuar como agentes quelantes del hierro, limitando la disponibilidad de este importante cofactor enzimático para las células bacterianas (148). Los compuestos fenólicos derivados de plantas con actividad antibacteriana han servido de base en la investigación para el desarrollo de nuevos antimicrobianos. Por ejemplo, el compuesto 3′,4′‑difluoroquercetina, un derivado semisintético de la quercetina, tiene actividad frente a cepas de P. aeruginosa resistentes a 28 carbapenemasas, inclusive, ha demostrado sinergia en combinación con ceftazidima en modelos de infección murinos (149). A partir de los monoterpenos fenólicos timol, carvacrol, guayacol y eugenol se han derivado moléculas semisintéticas con una mejoría en su perfil antibacteriano en comparación con los compuestos naturales de partida (150). 29 2. Justificación: Dada la relevancia del estrés oxidativo como una condición promotora de diferentes enfermedades, así como el impacto de las infecciones bacterianas en la salud pública, se propone la investigación para determinar el potencial antioxidante y antibacteriano in vitro de los extractos hidroalcohólicos producidos a partir de I. hawkeri. Esto ante el descubrimiento de extractos y metabolitos con dichas actividades en otras plantas del género Impatiens y a la amplia explotación agrícola de I. hawkeri. Vale la pena destacar que estudios preliminares han demostrado que la actividad antioxidante y antibacteriana para extractos de planta entera de I. hawkeri cultivada en territorio costarricense presenta diferencias en sus propiedades en comparación con plantas del mismo género cultivadas en otras latitudes, posiblemente por diferencias de especie y de condiciones ambientales y agronómicas. Lo cual respalda la relevancia de estudiar la actividad de extractos de plantas de este género cultivadas en Costa Rica. La actividad biológica de los extractos derivados de plantas puede variar en función de la parte anatómica de la planta utilizada para su producción, por lo que los extractos, que se propone estudiar serán elaborados a partir de toda la planta, las partes aéreas (hojas, flores y tallos en conjunto), la raíz, las hojas y el tallo. En primera instancia no se plantea la investigación de flores o frutos aislados por ser órganos cuya cantidad es reducida, considerándose poco viable obtener cantidades suficientes para su estudio. La revisión de antecedentes señala a los compuestos fenólicos como los principales componentes activos en plantas del género Impatiens. Por lo tanto, se plantea la cuantificación de los contenidos de fenoles totales, flavonoides totales y antocianinas monoméricas totales de los extractos de I. hawkeri. Asimismo, se propone la determinación de compuestos fenólicos bioactivos reportados en otras plantas del género en cuestión, correspondientes a quercetina, kaempferol, quercetina 3-O-β-D- rutinósido (conocido como rutina), quercetina 3-O-β-D-glucósido (conocido como isoquercetina), lawsona, 2-MNQ y escopoletina. 30 Mediante la investigación propuesta se pretende determinar la existencia de variaciones en la actividad antioxidante y antibacteriana en función de la sección de la planta I. hawkeri utilizada y a su vez correlacionar con los resultados de la cuantificación de compuestos fenólicos. Con los resultados obtenidos se espera establecer un antecedente sólido que defina cual sección anatómica de I. hawkeri presenta mayor potencial como fuente de extractos con las actividades biológicas evaluadas, ya sea para la investigación posterior de su actividad en modelos in vivo o para la identificación, aislamiento y elucidación estructural de sus componentes activos. 31 3. Hipótesis y objetivos: 3.1. Hipótesis: La magnitud de las actividades antioxidante y antibacteriana de los extractos hidroalcohólicos de I. hawkeri varía en función de la parte anatómica de la planta utilizada debido a las diferencias en su contenido de compuestos fenólicos. 3.2. Objetivos: 3.2.1. Objetivo general: Evaluar las actividades antioxidante y antibacteriana de los extractos hidroalcohólicos elaborados a partir de plantas enteras, partes áreas (tallo, hojas y flores en conjunto), hojas, tallos y raíces de Impatiens hawkeri mediante ensayos in vitro, así como la correlación de dichas actividades con la presencia de compuestos fenólicos bioactivos. 3.2.2. Objetivos específicos: 3.2.2.1. Caracterizar los extractos hidroalcohólicos de las distintas partes anatómicas de I. hawkeri a través de ensayos químicos de detección y cuantificación de compuestos fenólicos bioactivos. 3.2.2.2. Comparar la actividad barredora de radicales libres in vitro de los extractos hidroalcohólicos de las distintas partes anatómicas de I. hawkeri. 3.2.2.3. Estimar la capacidad inhibitoria de los extractos hidroalcohólicos de las diferentes secciones anatómicas de I. hawkeri sobre la peroxidación lipídica inducida en homogenizados de tejido hepático y eritrocitos. 3.2.2.4. Determinar la actividad estabilizadora de los extractos hidroalcohólicos de las distintas partes anatómicas de I. hawkeri sobre las especies reactivas de oxígeno (ROS) presentes a nivel intracelular. 32 3.2.2.5. Identificar la sección anatómica de Impatiens hawkeri que permite la obtención del extracto hidroalcohólico con mayor potencia antibacteriana in vitro definida sobre cepas de bacterias patógenas. 33 4. Materiales y métodos: 4.1. Recolección y procesamiento del material vegetal: La especie Impatiens hawkeri fue identificada previamente por el Dr. Carlos Morales, botánico del Herbario Dr. Luis A. Fournier Origgi, Escuela de Biología, Universidad de Costa Rica. Lo anterior mediante el depósito de un espécimen de referencia a la colección del herbario con el código USJ-110 989 (151). El material vegetal recolectado corresponde a plantas cultivadas las cuales fueron obtenidas comercialmente en el vivero Casa Verde ubicado en Grecia, Alajuela. Se utilizarán plantas de mes y medio de crecimiento procedentes de la Garita de Alajuela (coordenadas: 9°59′33″ Norte; 84°19′00″ Oeste). Se llevaron a cabo dos recolecciones de material vegetal, una durante febrero de 2020 y otra en febrero de 2021. Con el material de la primera recolección se prepararon cinco tipos de muestras: plantas enteras (incluyen todos los órganos de la planta: raíz, tallo, hojas y flores), partes áreas (incluyen flores, tallos y hojas en conjunto), raíces, tallos y hojas. Adicionalmente a las cinco muestras anteriores fue posible conseguir una cantidad de flores suficiente para la preparación de una cantidad adecuada de extracto hidroalcohólico. El material de las distintas muestras fue lavado con agua potable para remover material extraño: tierra, polvo y piedras adheridas a las raíces. Posteriormente, las muestras se sometieron a secado a 70 °C mediante horno (152). Sin embargo, en el caso particular de la muestra de flores, se empleó la técnica de liofilización como método de secado dado lo delicado del material y a la rápida decoloración que sufre mediante el secado por la aplicación de calor. Se realizó una segunda recolección de hojas de I. hawkeri en febrero de 2021. Este material fue utilizado para evaluar el efecto de la técnica de secado sobre la composición y las actividades de los extractos producidos a partir de ellas. Dicho material se dividió en tres muestras, cada una de las cuales fue sometida a un método distinto de secado: liofilización a -50 °C, secado al horno a 70 °C o secado a la sombra a temperatura ambiental (24±7 °C). Las distintas muestras secas (tanto del 2020 como 34 del 2021) fueron sujetas a molienda con procesador de alimentos hasta un tamaño de partícula inferior a 2 mm de espesor. El polvo obtenido de cada muestra fue utilizado para elaborar los distintos extractos hidroalcohólicos. 4.2. Preparación de los extractos hidroalcohólicos: Para la preparación de los extractos hidroalcohólicos de cada muestra se siguió el método de extracción descrito por Kang et al. (153) con modificaciones. En la primea etapa, el material seco y molido fue sometido a maceración en proporción 1:10 g/mL con etanol al 80 % v/v (154) durante dos semanas a temperatura ambiente en recipientes de vidrio ámbar. Posteriormente, el extracto hidroalcohólico fue retirado por decantación y filtrado al vacío utilizando un filtro Whatman N°4 (diámetro de poro de 20-25 μm). El extracto obtenido de la primera etapa fue almacenado a temperatura ambiente bajo protección de la luz. En la segunda etapa, el material vegetal contenido en el recipiente ámbar fue sometido nuevamente a maceración en proporción 1:15 g/mL de etanol al 80 % v/v durante una semana adicional a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de la segunda maceración, el extracto hidroalcohólico resultante fue retirado por decantación y filtrado al vacío utilizando un filtro Whatman N°4. Los filtrados de la primera y segunda etapa de maceración se combinaron y se sometieron a filtración nuevamente con filtro de celulosa de 0,45 μm de diámetro de poro. El etanol del extracto resultante fue eliminado por evaporación al vacío y la suspensión acuosa resultante se congeló a – 80 °C durante 12 horas. Luego, el agua fue eliminada mediante liofilización hasta obtener un extracto seco. Los extractos secos de cada muestra se almacenaron a – 80 °C hasta su análisis. Bajo las metodologías descritas anteriormente se obtuvieron un total de 9 extractos cuyo códigos y características se resumen en el cuadro IV. 35 Cuadro IV. Códigos asignados a los diferentes extractos hidroalcohólicos de I. hawkeri sujetos a estudio. Código Material vegetal Técnica de secado Período de recolección del material vegetal PEH-20 Plantas enteras Horno a 70 °C Febrero de 2020 PAH-20 Partes áreas Horno a 70 °C Febrero de 2020 HH-20 Hojas Horno a 70 °C Febrero de 2020 FL-20 Flores Liofilización a -50 °C Febrero de 2020 TH-20 Tallos Horno a 70 °C Febrero de 2020 RH-20 Raíces Horno a 70 °C Febrero de 2020 HL-21 Hojas Liofilización a -50 °C Febrero de 2021 HH-21 Hojas Horno a 70 °C Febrero de 2021 HS-21 Hojas Sombra (temperatura ambiente) Febrero de 2021 4.3. Análisis de los extractos mediante cromatografía en capa fina de alto desempeño (HPTLC): 4.3.1. Condiciones cromatográficas generales: Para los diferentes ensayos cromatográficos se emplearon placas de vidrio de 20x10 cm para cromatografía HPTLC recubiertas con gel de sílice 60 F254 o 60 F254S. Los estándares o sustancias de referencia de quercetina, kaempferol, rutina, isoquercetina, lawsona, 2-MNQ y escopoletina se disolvieron adecuadamente en metanol hasta una concentración exactamente conocida y se colocaron en viales ámbar para los análisis cromatográficos. De manera similar, se prepararon soluciones en 36 metanol de cada uno de los extractos a una concentración de 10 mg/mL las cuales también fueron transferidas a viales ámbar para su correspondiente análisis. Las soluciones de los estándares o de los extractos se aplicaron desde los viales en las placas para análisis HPTLC con ayuda del automuestreador ATS4 (CAMAG). El contenido de las soluciones estándar o de las muestras se aplicó en modo aerosol o spray, empleando nitrógeno como gas propelente a una velocidad de 150 nL/s, en forma de bandas de 8 mm de longitud y 1 mm de espesor a una distancia de 10 mm desde el fondo de la placa. La separación entre bandas fue de 3 mm. La distancia desde el borde lateral izquierdo hasta la primera banda aplicada se fijó en 20 mm. El frente de solvente se estableció a 80 mm desde el fondo de las placas de cromatografía. La cantidad máxima de muestra de extracto aplicada en cada placa fue de 1 mg/banda. Una vez finalizada la aplicación de los estándares o muestras en las placas cromatográficas, se procedió al presecado de las mismas durante 1 minuto, posteriormente se procedió a saturar la cámara de desarrollo cromatográfico con la correspondiente fase móvil y al desarrollo o elución de las placas de cromatografía. Al final de cada proceso de elución, las placas fueron sometidas a secado durante 5 minutos. Los procesos de presecado, saturación, elución y secado fueron realizados con la cámara de desarrollo automática ADC2 (CAMAG). La elución de las placas cromatográficas fue llevada a cabo a temperatura (24±3 °C) y humedad (51±3 %) ambiental. Las imágenes de los cromatogramas fueron obtenidas mediante la aplicación de luz ultravioleta (UV) con una longitud de onda de 254 nm o 366 nm. Para este fin se utilizó el equipo TLC Visualizar (CAMAG). La generación de densitogramas fue llevada a cabo con el equipo TLC Scanner 4 (CAMAG), para esto se aplicó una velocidad de escaneo de 20 mm/s, una resolución de 100 µm/paso y una ranura de 4x0,1 mm. Para las determinaciones de absorbancia se utilizó la lámpara de deuterio del equipo mientras que para las determinaciones en modo fluorescencia se utilizó la lámpara de mercurio como fuente de la radiación de excitación y el filtro de K400 para la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida. 37 El procesamiento y análisis de las imágenes de los cromatogramas y densitogramas fueron realizadas con el software VisionCATS 3.1. Los datos de absorbancia o fluorescencia medidos a los picos cromatográficos ubicados en los rangos de coeficiente de retención (Rf) correspondiente a cada compuesto analizado fueron utilizados para la construcción de rectas de calibración en función de la cantidad de sustancia por banda de los diferentes estándares. Estas rectas fueron utilizadas para determinar por interpolación la concentración de los compuestos bajo análisis en los extractos en miligramos por gramo. Los experimentos de determinación de los compuestos se realizaron al menos por triplicado para cada extracto evaluado. Los resultados se reportan como el promedio con su respectivo error estándar. 4.3.2. Condiciones para la determinación simultánea de quercetina y kaempferol: Para la determinación de quercetina y kaempferol se preparó una solución de ambos estándares (SE) con concentraciones de 120 y 100 µg/mL, respectivamente. Se colocaron distintas bandas en las placas para análisis HPTLC con contenidos para ambas sustancias de referencia en los rangos de 120-480 ng/banda, para la quercetina, y 100-400 ng/banda, para el kaempferol. Estas bandas fueron utilizadas para la construcción de rectas de calibración. Para la determinación de ambos compuestos en el extracto FL-20 se empleó como fase móvil a la mezcla tolueno: acetato de etilo: ácido fórmico (60:45:3 v/v/v) (fase móvil 1) con un tiempo de saturación de 10 minutos previo a la elución. Para el resto de los extractos se utilizó un sistema de doble elución, las placas fueron eluidas inicialmente con la fase móvil 1 y posteriormente con la fase móvil tolueno: acetato de etilo: n-hexano: ácido fórmico (60:30:10:3 v/v/v/v) (fase móvil 2) con períodos de saturación de 10 minutos antes de cada fase de elución. Las diferentes condiciones aplicadas para FL-20 con respecto al resto de extractos se debe a que con ello la separación de las bandas de los componentes es más adecuada para dicho extracto. Una vez finalizados los procesos de elución se procedió a la generación de imágenes de los cromatogramas a 366 nm y de densitogramas a 380 nm. En el sistema 38 empleado para la determinación de quercetina y kaempferol en FL-20 se utilizaron los datos de absorbancia medidos a picos cromatográficos presentes en los rangos de Rf de 0,410±0,017 y 0,553±0,010, respectivamente. Para el sistema empleado durante la determinación de ambos compuestos en el resto de los extractos se utilizaron los valores de absorbancia establecidos en picos cromatográficos ubicados en los rangos de Rf de 0,504±0,020 y 0,713±0,017, respectivamente. 4.3.3. Condiciones para la determinación simultánea de rutina e isoquercetina: Para la determinación de rutina e isoquercetina se preparó una solución de ambos estándares (SE) con concentraciones de 280 µg/mL. Se colocaron distintas bandas en las placas para análisis HPTLC con contenidos para ambos compuestos de referencia de entre 280 y 980 ng/banda. Estas bandas fueron utilizadas para la construcción de rectas de calibración. Para la determinación de rutina e isoquercetina en los extractos se utilizó un sistema de elución con la fase móvil butan-2-ol: n-butanol: acetato de etilo: ácido fórmico (60:40:15:10 v/v/v/v) (fase móvil 3) con un período de saturación de 20 minutos antes del proceso de elución. Una vez finalizada la etapa de elución cromatográfica se procedió a la generación de imágenes de los cromatogramas a 254 nm y de densitogramas a 365 nm. Los datos de absorbancia utilizados para la determinación de rutina e isoquercetina fueron medidos a los picos cromatográficos presentes en los rangos de Rf de 0,346±0,023 y 0,620±0,021, respectivamente. 4.3.4. Condiciones para la determinación simultánea de lawsona y 2-MNQ: Para la determinación de lawsona y 2-MNQ se preparó una solución de ambos estándares (SE) con concentraciones de 220 y 340 µg/mL, respectivamente. Se colocaron distintas bandas en las placas para análisis HPTLC con contenidos para ambas sustancias de referencia en los rangos de 220-440 ng/banda, para la lawsona, y 340-640 ng/banda, para 2-MNQ. Estas bandas fueron utilizadas para la construcción de rectas de calibración. 39 Para la determinación de lawsona y 2-MNQ en los extractos se utilizó un sistema doble elución. La primera etapa de elución se llevó a cabo con la fase móvil tolueno: acetato de etilo: ácido acético (80:30:3 v/v/v) (fase móvil 4), mientras que en la segunda etapa se utilizó la fase móvil tolueno: acetato de etilo: n-hexano: ácido acético (80:30:20:10 v/v/v/v) (fase móvil 5) con un período de saturación de 10 minutos antes de cada fase de elución. Una vez finalizados los procesos de elución cromatográfica se procedió a la generación de imágenes de los cromatogramas a 254 nm y de densitogramas a 275 nm. Los datos de absorbancia utilizados para la determinación de lawsona y 2-MNQ fueron medidos a los picos cromatográficos presentes en los rangos de Rf de 0,719±0,018 y 0,848±0,010, respectivamente. 4.3.5. Condiciones para la determinación de escopoletina: Para la determinación de escopoletina se preparó una solución de estándar (SE) de 300 µg/mL. Se colocaron distintas bandas en las placas para análisis HPTLC con contenidos para la sustancia de referencia en el rango de 30-300 ng/banda. Estas bandas fueron utilizadas para la construcción de la recta de calibración. Para la determinación de escopoletina en los extractos se utilizó un sistema doble elución. La primera etapa de elución se llevó a cabo con la fase móvil cloroformo: acetato de etilo: ácido fórmico (60:30:10 v/v/v) (fase móvil 6), mientras que en la segunda etapa se utilizó la fase móvil cloroformo: acetato de etilo (60:40 v/v) (fase móvil 7) con un período de saturación de 10 minutos antes de cada fase de elución. Una vez finalizados los procesos de elución cromatográfica se procedió a la generación de imágenes de los cromatogramas a 366 nm y a la generación de densitogramas mediante el análisis por fluorescencia, empleando una longitud de onda de excitación de 302 nm y realizando las lecturas de la intensidad de fluorescencia emitida con el filtro de detección K400. Los datos de fluorescencia utilizados para la determinación de escopoletina fueron medidos a los picos cromatográficos presentes en el rango de Rf de 0,623±0,037. 40 4.4. Determinación del contenido de compuestos fenólicos totales (TPC): La cuantificación de los compuestos fenólicos totales se estableció mediante el método Folin-Ciocalteu, el cual consiste en la transformación de complejos de fosfomolibdato VI a fosfomolibdato V de color azul por la acción reductora de los compuestos fenólicos presentes en el medio en que tiene lugar la reacción. El ensayo se efectuó de acuerdo con el procedimiento descrito por Bobo-García et al. (155). Para la construcción de la recta de calibración de ácido gálico se empleó soluciones estándar con concentraciones de 20 a 200 µg/mL. Además, se prepararon soluciones de prueba de los extractos con una concentración adecuada para su análisis por interpolación en la recta estándar ácido gálico. Para el análisis se tomaron alícuotas de 20 µL de las soluciones estándar o de las soluciones de los extractos liofilizados y se colocaron en pozos independientes de una microplaca de poliestireno de 96 pozos. Posteriormente se procedió a añadir 100 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu (RFC) 0,4 N a cada uno de los pozos seguido de la adición de 75 µL de carbonato de sodio 100 g/L. La placa se agitó durante 30 segundos y se mantuvo en reposo en el interior del lector de microplacas por 2 horas a 25±1°C. Después del período de reposo, se procedió a la lectura de la absorbancia a 750 nm. La absorbancia obtenida con las soluciones estándar de ácido gálico fue corregida mediante la sustracción de la absorbancia del blanco correspondientes a 20 µL de agua destilada sometidos al procedimiento de análisis. Adicionalmente, la absorbancia obtenida con las soluciones de los extractos fue corregida mediante la sustracción de la absorbancia obtenida con el blanco de muestra, correspondiente a 20 µL de la disolución de extractos sometidos a análisis sustituyendo los 100 µL de RFC 0,4 N por 100 µL de agua destilada. De este modo se corrigió la interferencia debida a la absorbancia intrínseca de las soluciones de los extractos. La cantidad de TPC en miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de extracto (mg GAE/g) se determinó por interpolación de la absorbancia corregida de las soluciones de los extractos sujetas a análisis en la recta estándar obtenida de la regresión lineal de la absorbancia en función de la concentración de ácido gálico. El experimento se repitió 41 por triplicado para cada extracto. Los resultados se reportan como el promedio con su respectivo error estándar. 4.5. Determinación del contenido de flavonoides totales (TFC): La cuantificación colorimétrica de flavonoides se efectuó mediante el ensayo de formación de complejos de los flavonoides con cloruro de aluminio. Para ello se siguió el método descrito por Magalhães et al. (156) con modificaciones. La quercetina se empleó como el compuesto de referencia para la cuantificación de flavonoides presentes en los extractos liofilizados. Para la construcción de la recta estándar se utilizaron soluciones de quercetina con concentraciones de 20 µg/mL a 60 µg/mL en metanol. Además, se prepararon soluciones de prueba de concentración adecuada para la cuantificación de flavonoides con cada uno de los extractos liofilizados empleando agua como solvente. Con respecto al procedimiento del análisis, se tomaron alícuotas de 50 µL de las soluciones estándar de quercetina y de las soluciones de los extractos. Estas se colocaron en pozos independientes de una microplaca de poliestireno de 96 pozos. Posteriormente se añadieron 50 µL de nitrito de sodio 6 g/L a cada uno de los pozos, seguido de un período de reposo de 5 minutos en el interior del equipo lector de microplacas. Después de transcurrido este lapso, se procedió a añadir 50 µL de una solución acuosa de cloruro de aluminio hexahidratado 22 g/L. Seguidamente, la placa se dejó en