UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO COMPORTAMIENTO EPIDEMIOLÓGICO Y MICROBIOLÓGICO DE LAS ONICOMICOSIS EN LABORATORIO CLÍNICO PRIVADO (COSTA RICA, MARZO 2022 – JULIO 2023) Trabajo final de graduación sometido a la consideración de la Comisión del Programa de Posgrado de Especialidad en Microbiología para optar al grado y título de Especialidad en Micología Médica JOSÉ CARLOS GAMBOA SOLANO Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2025 ii DEDICATORIA Quisiera dedicar el presente trabajo a Dios y a mi familia que me ha apoyado en cada paso del camino. A mi madre Cinthia Solano y mi padre Ronnie Gamboa. A mis hermanos Ronnie, Kenneth y Rocie. A mi abuelita Flora por siempre creer en mi y apoyarme y a mi tía Flor Solano por enamorarme de las ciencias de la salud. A Ángel por su apoyo en este proceso. iii AGRADECIMIENTO A la Dra. Daniela Jaikel por guiarme en el proceso de la especialidad, desde el día donde en la licenciatura al terminar el curso de Micología Médica me dijo que yo sí podía ser especialista en hongos. A la Dra Andrea Ruiz y la Dra.Yosselin Morales por inspirar el presente trabajo con su excelente forma de manejar las micosis en sus laboratorios. Al Diplomado Kevin Alvarado Mesen por su apoyo técnico en la realización de este trabajo. iv HOJA DE APROBACIÓN Este trabajo final de graduación fue aceptado por la Comisión del Programa de Posgrado en Especialidad en Microbiología de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Especialidad en Micología Médica MSc. Daniela Jaikel Víquez Profesora Tutora Esp. Andrea Ruiz Profesora Lectora MSc. Melissa Granados Zamora Profesora Lectora José Carlos Gamboa Solano Postulante v TABLA DE CONTENIDO DEDICATORIA ............................................................................................................. ii AGRADECIMIENTO ................................................................................................... iii HOJA DE APROBACIÓN ............................................................................................ iv TABLA DE CONTENIDO ............................................................................................ v RESUMEN .................................................................................................................. viii ABSTRACT .................................................................................................................. ix LISTA DE CUADROS .................................................................................................. x LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... xi LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... xiii INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1 OBJETIVOS ................................................................................................................... 3 Objetivo General. ............................................................................................................ 3 Objetivos específicos. ..................................................................................................... 3 CAPITULO 1. GENERALIDADES DE LAS ONICOMICOSIS ................................. 4 1.1 Onicomicosis. ........................................................................................................... 4 1.2. Manifestaciones clínicas. ......................................................................................... 4 1.2.1. Onicomicosis distales y laterales sub-ungueales (ODLS). ................................... 4 1.2.2. Onicomicosis superficiales blancas (OSB). .......................................................... 5 1.2.3. Onicomicosis sub-ungueales proximales (OSP). .................................................. 5 1.2.4. Onicomicosis endonix (OE). ................................................................................ 6 1.2.5. Onicomicosis con distrofia total (ODT). .............................................................. 6 1.3. Agentes etiológicos. ................................................................................................. 6 1.3.1. Dermatofitos. ........................................................................................................ 6 1.3.1.1: Trichophyton rubrum. ........................................................................................ 7 1.3.1.2: Complejo Trichophyton mentagrophytes/T. interdigitale. ................................ 8 1.3.1.3: Epidermophyton floccosum. .............................................................................. 9 1.3.1.4: Nannizzia gypsea. .............................................................................................. 9 1.3.2. Hongos filamentosos no dermatofitos. ............................................................... 10 1.3.2.1. Aspergillus spp. ............................................................................................... 10 1.3.2.2. Fusarium spp. .................................................................................................. 11 1.3.2.3. Scopulariopsis brevicaulis. .............................................................................. 12 vi 1.3.2.4. Neoscytalidium dimidiatum. ............................................................................ 13 1.3.3. Hongos levaduriformes. ...................................................................................... 14 1.4. Diagnóstico. ........................................................................................................... 15 1.4.1. Recolección de la muestra. ................................................................................. 15 1.4.2. Examen directo. .................................................................................................. 15 1.4.3. Cultivo. ............................................................................................................... 16 1.4.1.- Técnicas alternativas de diagnóstico. ................................................................ 18 1.5. Epidemiología de las onicomicosis. ...................................................................... 19 1.6. Tratamiento. ........................................................................................................... 19 1.6.1. Antifúngicos tópicos. .......................................................................................... 20 1.6.1.1. Pomada con urea al 40 %. ............................................................................... 20 1.6.1.2. Laca de ciclopirox olamina al 8 %. ................................................................. 21 1.6.1.3. Laca de amorolfina al 5 %. .............................................................................. 21 1.6.1.4. Solución alcohólica de tioconazol al 28 % con ácido undecilínico. ................ 21 1.6.2. Antifúngicos orales. ............................................................................................ 22 1.6.2.1. Fluconazol. ...................................................................................................... 22 1.6.2.2. Itraconazol. ...................................................................................................... 22 1.6.2.3. Terbinafina. ...................................................................................................... 23 1.6.2.4. Combinación de antifúngicos. ......................................................................... 24 1.6.3. Terapias láser. ..................................................................................................... 24 1.6.4. Terapia fotodinámica. ......................................................................................... 24 1.6.5. Tratamientos misceláneos. .................................................................................. 25 2. METODOLOGIA ..................................................................................................... 26 2.1 Diseño de investigación. ......................................................................................... 26 2.1.1 Revisión bibliográfica. ......................................................................................... 26 2.1.2 Revisión de datos de laboratorio. ........................................................................ 26 2.2. Criterios de inclusión. ............................................................................................ 27 2.3 Criterios de exclusión. ............................................................................................ 27 2.4 Permisos. ................................................................................................................. 27 2.5 Codificación de los datos. ....................................................................................... 28 3. RESULTADOS ........................................................................................................ 29 3.1. Información general de los pacientes en estudio. .................................................. 29 3.2. Información microbiológica de las muestras en estudio. ...................................... 30 4. DISCUSION. ............................................................................................................ 33 vii 5. CONCLUSIONES. ................................................................................................... 38 6. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 39 7. ANEXOS. ................................................................................................................. 45 Anexo 1. Especies que identifica el sistema EUROArray Dermatomicosis. .............. 45 Anexo 2. Certificación del CONIS del Investigador principal, tutora y lectoras. .... 46 Anexo 3. Aprobación por parte del Comité Ético Científico de la Universidad de Costa Rica ........................................................................................................................ 50 Anexo 4. LE-RA-I10 v2 Sección 4, 6, 7, 8 y 9 ............................................................... 52 viii RESUMEN Las onicomicosis representan una de las onicodistrofias más comunes en la población, a nivel mundial. Los agentes etiológicos de estas enfermedades son, primeramente, los dermatofitos, seguidos por el género Candida y, finalmente, los hongos filamentosos no dermatofitos. En el presente estudio se analizaron los resultados de examen directo y cultivo por hongos de 177 pacientes que se presentaron por sospecha de onicomicosis, en manos y pies, en un laboratorio privado en San José, Costa Rica. De los 177 pacientes, 135 (76.3 %) presentaron un examen directo y cultivo positivos por hongos, 11 (6.3 %) únicamente examen directo positivo y ninguno presentó examen directo negativo y cultivo positivo. De las muestras positivas por cultivo (n = 135), 87 (64.4 %) eran dermatofitos, 27 (20.0 %) eran levaduras, 16 (11.9 %) eran hongos filamentosos no dermatofitos y 5 (3.7 %) correspondían a infecciones mixtas por dos hongos. Únicamente una muestra proviene de una onicomicosis en uñas de la mano. La presencia de aislamientos de hongos filamentosos no dermatofitos que no responde al tratamiento convencional como N. dimidiatum nos recalca la importancia del cultivo en el diagnóstico de las onicomicosis. ix ABSTRACT Onychomycoses represent one of the most common onychodystrophies in the population. Dermatophytes and Candida are described as the main etiological agents of this illness Additionally, non-dermatophyte filamentous fungi can also be etiological agents. In the present study, the clinical reports of 177 patients, from a private laboratory in San José, Costa Rica, who were suspected of having onychomycosis, were analyzed. Out of the 177 patients, 135 (76.3 %) had a positive culture and direct examination, 11 (6.3 %) only had a positive direct examination, and none had negative direct examination with positive culture. Of the samples positive by culture (n = 135), 87 (64.4 %) were dermatophytes, 27 (20.0 %) yeasts, 16 (11.9 %) were non-dermatophyte filamentous fungi, and 5 (3.7 %) had mixed infections by two fungi. Only one sample was from onychomycosis in fingernails. The presence of non- dermatophyte filamentous fungi isolates that do not respond to conventional treatment, such as N. dimidiatum, highlights the importance of culture in the diagnosis of onychomycosis. x LISTA DE CUADROS Cuadro 1. Estructuras observadas en el examen directo…………………………...………..29 Cuadro 2. Microorganismos aislados a partir de las onicomicosis diagnosticadas en un laboratorio clínico privado de marzo 2022 a julio 2023………………………………………………………………………………………..30 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. A. Apariencia microscópica de Trichophyton rubrum. Se observa micelio hialino septado y microaleurias piriformes. B. Apariencia macroscópica de T.rubrum. La fotografía presenta el anverso de la colonia, caracterizada por un coloración blanca-crema algodonosa…………………………………………………………………………………..8 Figura 2. A. Apariencia microscópica de aislamiento del complejo T. mentagrophytes (se señala con una flecha el micelio en espiral). B. Apariencia macroscópica de aislamiento del complejo T. mentagrophytes.…………………………………..…………………………...8 Figura 3. A. Apariencia microscópica aislamiento de E. floccosum. En la fotografía se observa micelio hialino septado y macroaleuriosporas en racimos. B. Apariencia macroscópica de aislamiento de E. floccosum …...…………………………………….….....9 Figura 4. A. Apariencia microscópica de un aislamiento de N. gypsea. En la fotografía se observa micelio hialino, septado y macroaleuriosporas. B. Apariencia macroscópica de una colonia de N. gypsea……………………………...…………….……………………………10 Figura 5. A. Conidióforo complejo de A. niger. B. Apariencia macroscópica de de A. niger..……………………………..……………………………….………….…………....11 Figura 6. A. Apariencia microscópica de aislamiento de Fusarium sp. En la fotografía se observan microconidias y macroconidias fusiformes. B. Apariencia macroscópica algodonosa con pigmento naranja de Fusarium sp………………………………………………...…………..……………………………..12 Figura 7. A. Morfología microscópica de S. brevicularis. En la fotografía se observa micelio hialino septado y conidióforos ramificados. B. Apariencia macroscópica de aislamiento de S. brevicularis (Imagen tomada de (1))…………………….………………………………..12 Figura 8. A. Apariencia microscópica de N. dimidiatum. En la fotografía se observa micelio fuliginoso, septado y artrosporado. B. Apariencia macroscópica de la colonia de N. dimidiatum…………………………………………….…...……..……………………………..13 xii Figura 9. Distribución etaria de los pacientes atendidos por sospecha de onicomicosis en un laboratorio clínico privado de Costa Rica. (n = 177)……..……..…………………………..29 Figura 10. A y B. Infección mixta por Fusarium sp. y T. rubrum, vista macroscópica. C y D. Infección mixta por Fusarium sp. y T. rubrum, vista microscópica. E. Infección mixta por C. duobushaemulonii y T. rubrum vista macroscópica. F. Infección mixta por C. albicans y Fusarium sp. vista macroscópica………….…………………………………..………………………………..32 xiii LISTA DE ABREVIATURAS H HFND: Hongo filamentoso no dermatofito. HIV: Virus de la inmunodeficiencia humana. K KOH: Hidróxido de potasio M MALDI-TOF: Espectrometría de masas del inglés, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight L LE-RA-I10: Manual de Toma de Muestra y Procesamiento de Micosis Superficiales. O ODLS: Onicomicosis distales y laterales sub-ungueales. ODT: Onicomicosis con distrofia total. OE: Onicomicosis endonix. OSB: Onicomicosis superficiales blancas. OSP: Onicomicosis sub-ungueales proximales. P PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. R RFLP: Secuenciación de polimorfismos de restricción. 1 INTRODUCCIÓN Las onicomicosis se definen como infecciones del lecho ungueal causada por hongos. Esta enfermedad se caracteriza por ser la afectación del lecho ungueal más común, representando el 50 % de estos padecimientos. Entre las manifestaciones clínicas más frecuentemente reportadas están los cambios en la coloración, engrosamiento y onicocriptosis por cambios en la morfología de la uña (2–5). Los agentes etiológicos más comunes de las onicomicosis se dividen en tres grupos: dermatofitos, hongos filamentosos no dermatofitos (HFND) y hongos levaduriformes. Los dermatofitos representan la mayor proporción de especies aisladas en la literatura (6). Un estudio realizado en Costa Rica, en la Sección de Micología Médica de la Universidad de Costa Rica, reportó que los dermatofitos representaron el 70.1 % de las onicomicosis en pies y el 4.7 % de las onicomicosis en manos (7). Entre los dermatofitos más comúnmente aislados destacan Trichophyton rubrum y complejo Trichophyton mentagrophytes/Trichophyton interdigitale. Entre los hongos levaduriformes causantes de onicomicosis destacan Candida albicans y Candida parapsilosis, principalmente. Por otro lado, HFND presentan varias especies capaces de causar onicomicosis como Fusarium spp., Neoscytalidium dimidiatum, Acremonium spp. y Alternaria spp., entre otros (6). El diagnóstico de laboratorio consiste en la identificación de elementos fúngicos mediante microscopía, utilizando reactivos como el hidróxido de potasio (KOH) al 40 % y un posterior cultivo (agar glucosado de Sabouraud y agar Mycosel®) para identificar las especies involucradas. Este diagnóstico se ve influenciado por la calidad de la muestra, así como la experiencia del laboratorista para discriminar entre organismos causantes de las lesiones, organismos saprofíticos de la uña y contaminantes (8). Las onicomicosis representan el padecimiento micológico más frecuentemente atendido en un laboratorio clínico. En los laboratorios de índole privado la mayoría de los pacientes vienen referidos por podólogos o dermatólogos. La alta demanda de este tipo de exámenes de laboratorio requiere la realización de protocolos de toma de muestra y 2 diagnóstico de las mismas, así como capacitación al personal de laboratorio. Un diagnóstico eficaz permite brindar al paciente un tratamiento oportuno, mejorando así su calidad de vida (9–11). Finalmente, es fundamental resaltar que esta entidad no solo afecta a nivel físico, sino que también tiene un alto impacto a nivel emocional; ya que puede llegar a generar estigmatización y exclusión social. Estas implicaciones en la calidad de vida junto con la importancia de un diagnóstico oportuno para el tratamiento de la onicomicosis demuestran la necesidad de generar información con respecto al comportamiento epidemiológico y microbiológico de la enfermedad (11). Por lo tanto, el presente trabajo pretende describir los casos de onicomicosis diagnosticados en un laboratorio clínico privado para así contribuir con el conocimiento epidemiológico de esta enfermedad en nuestro país. 3 OBJETIVOS Objetivo General. Determinar las características microbiológicas y epidemiológicas de los casos de onicomicosis atendidos en un laboratorio clínico privado en San José, Costa Rica, en el periodo comprendido entre marzo 2022 - julio 2023. Objetivos específicos. • Describir las generalidades de las onicomicosis. • Identificar las características demográficas de los pacientes en estudio. • Analizar los agentes etiológicos que generan onicomicosis en la población en estudio, así como la relación del examen directo con el cultivo. 4 CAPITULO 1. GENERALIDADES DE LAS ONICOMICOSIS 1.1 Onicomicosis. La onicomicosis se define como una infección de una o más partes del lecho ungueal producida por agentes fúngicos. Estos hongos se agrupan en tres grupos: dermatofitos, hongos levaduriformes y HFND. La palabra onicomicosis proviene del griego ¨onyx¨ que significa uña y ̈ mykes¨ que significa hongo (12). Esta enfermedad también es conocida como ¨tinea unguium¨, sin embargo, hay que aclarar que el término “tinea” es sinónimo de infección por dermatofitos, por lo que esta terminología debería ser utilizada, únicamente, para referirse a las onicomicosis causadas por este grupo de hongos. Las onicomicosis son padecimientos retadores para los médicos y los pacientes. Lo anterior debido a las dificultades en el diagnóstico y los escasos tratamientos disponibles, que, además, son hongo- específicos. En ocasiones se refiere a las onicomicosis solamente como un problema estético. Sin embargo, como se mencionó en la introducción, estas lesiones afectan la calidad de vida de los pacientes limitando su movilidad, generando dolor, así como afectaciones psicológicas (13). 1.2. Manifestaciones clínicas. A nivel clínico se pueden dividir en distales y laterales sub-ungueales, superficiales blancas, proximales sub-ungueales, onicomicosis por Candida y onicomicosis con distrofia total (8). A continuación, se describen estos términos con más detalle. 1.2.1. Onicomicosis distales y laterales sub-ungueales (ODLS). La colonización del hongo se da a través del hiponiquio. Se lleva a cabo una invasión de la superficie inferior de la placa ungueal y se extiende en dirección proximal. Se asocia a tinea pedis y generalmente afecta una o varias uñas del pie (14) A nivel visual la lámina ungueal presenta un color blanco amarillento, con desprendimiento e hiperqueratosis 5 subungueal distal. En menor proporción se observan coloraciones marrones, negras o anaranjadas (15). Es importante resaltar que se ha reportado la producción de dermatofitomas. El dermatofitoma es un cúmulo o agrupación densa de micelio y escamas, a nivel subungueal. El problema es que los antifúngicos, especialmente, los tópicos tienen poca penetración en esta estructura tan densa, por lo que requiere escisión de la zona y tratamiento oral (16). La pigmentación negra de la uña se asocia a hongos fuliginosos como N. dimidiatum, así como variantes que generan melanina en hongos como T. rubrum. La presentación de HFND se asocia a inflamación periungeal. Entre los diagnósticos diferenciales de la ODLS se encuentran: onicólisis traumática y psoriasis ungueal (15). 1.2.2. Onicomicosis superficiales blancas (OSB). La colonización del hongo se caracteriza por ser superficial y presentarse en la superficie dorsal de la uña. Se generan lesiones blancas y opacas fáciles de raspar. Se describe a T. interdigitale como el agente etiológico clásico de esta presentación y a Fusarium y otros HFND como agentes causales de OSB con una invasión más profunda del lecho ungueal. Generalmente se presenta en uno o más dedos y es más común en pies. Al igual que el anterior, se asocia a tinea pedis (17). Entre los diagnósticos diferenciales se encuentran: fragilidad por uso prolongado de uñas postizas y leuconiquia asociada a trauma (15). 1.2.3. Onicomicosis sub-ungueales proximales (OSP). Se presenta de manera proximal en la superficie sub-ungueal ventral. La colonización inicia en el estrato corneo proximal. Esto genera leuconiquia en el área afectada e inflamación. Por lo general no se da por dermatofitos, sus principales agentes son hongos levaduriformes y HFND como Fusarium spp. y Aspergillus spp.. La presentación de OSP por T. rubrum se asocia a pacientes con VIH en fase SIDA (13). 6 1.2.4. Onicomicosis endonix (OE). Se caracteriza por un contraste entre la gran cantidad de elementos fúngicos en la uña y la ausencia de elementos fúngicos en el lecho ungueal. El lecho ungueal no presenta cambios en la morfología (inflamación o hiperqueratosis). Esta se adhiere a la capa más baja de la superficie de la uña. Es producida por especies especificas de Trichophyton soudanensenail y se asocia a la alta afinidad de esta especie por las queratinas duras (18). 1.2.5. Onicomicosis con distrofia total (ODT). Se considera la etapa más severa de las onicomicosis. Es el resultado de una ODLS o una OSP de largo plazo (años). El lecho ungueal se observa engrosado, amarillento y friable (19). 1.3. Agentes etiológicos. Las onicomicosis tienen una gran diversidad de agentes etiológicos involucrados. Los agentes involucrados se pueden dividir en dermatofitos, HFND y hongos levaduriformes. 1.3.1. Dermatofitos. Los dermatofitos se caracterizan por ser organismos miceliales que producen largas cadenas de esporas en su fase parasitaria (micelio artrosporado) para penetrar el estrato córneo. Esto es posible por la presencia de queratinasas que tienen la capacidad de romper la queratina Estos generan un grupo de enfermedades llamadas tiñas o “tineas”. Existen diferencias epidemiológicas entre las infecciones por dermatofitos en población pediátrica y adulta. Las onicomicosis por dermatofitos son poco comunes en niños y al mismo tiempo representan la mayoría de los casos en adultos (20). Los dermatofitos se clasifican en tres grandes grupos, según su ecología: (1) dermatofitos zoofílicos: se encuentran principalmente en animales, pueden transmitirse a 7 seres humanos; dermatofitos antropofílicos: se encuentran principalmente en seres humanos, en algunas ocasiones se transmiten a animales y dermatofitos geofílicos: se encuentran principalmente en el suelo, en diversos sustratos con queratina. Pueden transmitirse tanto a animales como seres humanos (21). Los hongos T. rubrum y el complejo T. mentagrophytes/T. interdigitale. representan entre el 80 y 90 % de los casos de onicomicosis causadas por dermatofitos (6). Epidermophyton floccosum es otra especie asociada a las onicomicosis, esta menos frecuente que las dos primeras. Otras especies involucradas son: Microsporum spp., Nannizia gypsea, Trichophyton verrucosum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton violaceum, Trichophyton soundanense, Trichophyton krajdenii, Trichophyton equinum y Arthroderma spp. (5,22,23). Las características microscópicas y macroscópicas de los principales dermatofitos asociados a onicomicosis se describirán a continuación. 1.3.1.1: Trichophyton rubrum. T. rubrum presenta en su forma microscópica micelio hialino septado con escasas macroaleuriosporas y microaleuriosporas con formas piriformes o alargadas. Es ureasa negativa y su colona es lisa, granular o algodonosas. Presenta un color blanco o crema y un reverso con el característico pigmento rojo (Figura 1) (21). 8 A B Figura 1. A. Apariencia microscópica de Trichophyton rubrum. Se observa micelio hialino septado y microaleurias piriformes. B. Apariencia macroscópica de T. rubrum. La fotografía presenta el anverso de la colonia, caracterizada por un coloración blanca-crema algodonosa. Fotografías propias. 1.3.1.2: Complejo Trichophyton mentagrophytes/T. interdigitale. El complejo T. mentagrophytes/T. interdigitale presenta una forma microscópica con micelio hialino septado y micelio en espiral, así como microaleuriosporas en forma de perla o lágrima, en grupos y macroaeuriosporas habitualmente ausentes. En su forma macroscópica presentan una colonia algodonosa, sobre elevada que se extiende rápidamente, de color crema. Además, la colonia puede tener zonas lisas y granulares. Al reverso se observa un pigmento claro, amarillo o amarillo marrón (Figura 2) (21). A B Figura 2. A. Apariencia microscópica de un aislamiento del complejo T. mentagrophytes (se señala con una flecha el micelio en espiral). B. Apariencia macroscópica de aislamiento del complejo T. mentagrophytes. Fotografías propias. 9 1.3.1.3: Epidermophyton floccosum. E. floccosum presenta en su estructura microscópica micelio hialino septado con abundantes macroaleuriosporas en racimos o aisladas; no presenta microaleuriosporas Las macroaleuriosporas presentan de tres a nueve septos, una pared que suele ser moderadamente gruesa, lisa y con extremos redondeados. La apariencia macroscópica se observa como colonias visibles entre siete y nueve días, de apariencia plegadas, aterciopeladas, pulverulentas y de color amarillo-verdoso. Rápidamente las colonias se vuelven estériles y se blanquean (Figura 3) (21). A B Figura 3. A. Apariencia microscópica aislamiento de E. floccosum. En la fotografía se observa micelio hialino septado y macroaleuriosporas en racimos. B. Apariencia macroscópica de aislamiento de E. floccosum. Fotografías propias. 1.3.1.4: Nannizzia gypsea. N. gypsea presenta morfología microscópica con micelio hialino, septado y abundantes macroaleuriosporas de paredes equinulada, delgadas y claviformes. En su forma macroscópica se observan colonias de crecimiento rápido, pulverulentas, color canela (Figura 4) (24). 10 A B Figura 4. A. Apariencia microscópica de un aislamiento de N. gypsea. En la fotografía se observa micelio hialino, septado y macroaleuriosporas. B. Apariencia macroscópica de una colonia de N. gypsea. Fotografías propias. 1.3.2. Hongos filamentosos no dermatofitos. Entre los HFND causantes de onicomicosis podemos mencionar: Alternaria spp, Aspergillus spp, Fusarium spp, Scytalidium spp, Neoscytalidium spp. y Scopulariopsis spp, entre otros (6). A excepción de N. dimidiatum y Fusarium spp, diversos autores los describen como contaminantes o especies invasoras secundarias por la ausencia de queratinasas (25). 1.3.2.1. Aspergillus spp. Las especies del género Aspergillus se han colocado como especies emergentes causantes de onicomicosis. Para el reporte de este género como agente causal de este tipo de lesiones se utilizan los Criterios de Walsh & English: (1) examen directo positivo compatible, (2) aislamiento por cultivo (crecimiento en al menos 5 de 20 inóculos) o detección por biología molecular en dos muestras, esto en ausencia de dermatofitos. La literatura describe a Aspergillus terreus y Aspergillus niger como los agentes etiológicos más comúnmente aislados, otras especies menos frecuentes son: Aspergillus tubingensis, Aspergillus sydowii, Aspergillus alliaceus, Aspergillus candidus, Aspergillus versicolor, Aspergillus unguis, Aspergillus persii, Aspergillus sclerotiorum, Aspergillus uvarum, Aspergillus melleus, Aspergillus tamarii y Aspergillus nomius (26). 11 Aspergillus spp. presentan una morfología con micelio hialino, septado y conidióforos complejos. Los cuales se encuentran en el extremo de una hifa o tallo, con una vesícula rodeada de fiálides en forma de botella. De las fiálides de desprenden las conidias. Este género se compone de aproximadamente 600 especies, lLas cuales tienen variantes en su morfología tanto microscópica como macroscópica (Figura 5). A B Figura 5. A. Conidióforo complejo de A. niger. B. Apariencia macroscópica de de A. niger. Imagen microscópica tomada de (27). Fotografía macroscópica propia. 1.3.2.2. Fusarium spp. Las especies del género Fusarium están ampliamente descritas como agentes causales de onicomicosis; son hongos hialinos con una amplia distribución geográfica. Las especies más comúnmente aisladas corresponden a los complejos Fusarium solani y Fusarium oxysporum (5,25). Este género se caracteriza por generar colonias con abundante micelio aéreo, tonos rosados, morados, anaranjados hasta colonias blancas. A nivel microscópico presenta micelio hialino, septado y macroconidias fusiformes a ovoides, ligeramente curvados cuando son septadas. Pueden presentar uno, dos o tres septos (Figura 6) (28). 12 A B Figura 6. A. Apariencia microscópica de aislamiento de Fusarium sp. En la fotografía se observan microconidias y macroconidias fusiformes. B. Apariencia macroscópica algodonosa con pigmento naranja de Fusarium sp. Fotografías propias. 1.3.2.3. Scopulariopsis brevicaulis. S. brevicaulis corresponde un hongo aislado comúnmente de suelo, plantas y alimentos. Algunos estudios lo asocian con alrededor del 2 y el 5 % de los casos de onicomicosis. Este microorganismo toma importancia por ser multirresistente (29). Presenta colonias de rápido crecimiento y con morfología pulverulenta, de color bronce a beige. Al reverso se observa un discreto pigmento bronce con un centro café. Microscópicamente se observan conidias en cadenas con una conidia de base más joven antes de la punta del conidióforo. Las conidias son de pared gruesa, redondeadas o con forma de limón. Con paredes celulares hialinas a café (Figura 7) (1). A B Figura 7. A Morfología microscópica de S. brevicularis. En la fotografía se observa micelio hialino septado y conidióforos ramificados. B. Apariencia macroscópica de aislamiento de S. brevicularis (Imagen tomada de (1)). 13 1.3.2.4. Neoscytalidium dimidiatum. N. dimidiatum es un hongo fuliginoso reportado en la literatura como causante de alrededor del 4 % de los casos de onicomicosis. Es más comúnmente aislado en uñas de los pies y su importancia es por su alta resistencia a los antifúngicos (30). Su morfología microscópica en cultivo corresponde a micelio artrosporado fuliginoso y micelio fuliginoso. El aspecto macroscópico corresponde a colonias blancas y algodonosas al principio, con el tiempo se tornan negruzcas y abarcan todo el agar (Figura 8) (1,31). A B Figura 8. A. Apariencia microscópica de N. dimidiatum. En la fotografía se observa micelio fuliginoso, septado y artrosporado. B. Apariencia macroscópica de la colonia de N. dimidiatum. Fotografías propias. Otras especies reportadas en la literatura incluyen: Penicillium spp., Geotrichum spp. y Acremonium spp. Así como géneros de hongos fuliginosos aislados con muy poca frecuencia como: Curvularia, Drechslera, Exophiala y Ulocladium (5). 14 1.3.3. Hongos levaduriformes. La especie C. albicans representa alrededor del 70 % de las onicomicosis causadas por hongos levaduriformes (6). Otras especies de involucradas incluyen: C. parapsilosis y Candida tropicalis, Pichia kudriavzevii, Meyerozyma guilliermondii, Debaryomyces hansenii, así como Yarrowia lipolytica (32). Algunos estudios describen a Candida spp. como el principal agente etiológico presente en onicomicosis en uñas de las manos (33). Las especies de Candida y sus géneros afines, se caracterizan por ser hongos levaduriformes que producen blastosporas ovaladas, de pared delgada que presentan un diámetro entre 3 a 5 µm. Estos hongos presentan gemación como principal forma de reproducción. Todas las especies menos Nakaseomyces glabrata generan estructuras ramificadas comunicadas por finos septos (pseudomicelio y micelio) (34). Entre los factores de riesgo de onicomicosis ocasionadas por levaduras se encuentran diabetes, inmunosupresiones y traumatismos ungueales (35). Trichosporon spp. es un hongo levaduriforme que se ha descrito como agente causal de onicomicosis, siendo Trichosporon asahii el organismo más aislado. Normalmente se consideran contaminantes. Presentan colonias cerebriformes, similares a levaduras en agar de dextrosa Sabouraud. Las colonias son de color crema, pero pueden oscurecerse a un gris amarillento. Son altamente arrugadas; el centro de la colonia se amontona y parece plegado. En los montajes a partir de agar de harina de maíz-tween 80, se observa mejor el micelio o pseudomicelio y las blastosporas y artrosporas solas o en cadenas cortas. Todas las especies de Trichosporon hidrolizan urea, lo que las distingue de Geotrichum, que también produce artrosporas (36,37). 15 1.4. Diagnóstico. 1.4.1. Recolección de la muestra. Las onicomicosis son un padecimiento que requiere confirmación del laboratorio clínico, este proceso de diagnóstico se divide en: examen directo y cultivo. Las muestras son tomadas utilizando “nippers” (alicates de manicura), estiletes acanalados y/o bisturís sin filo. Lo anterior dependiendo del nivel de distrofia de la uña, de la presentación clínica de la onicomicosis, entre otros. Se deben tomar en cuenta las indicaciones pre-analíticas para el paciente: dejarla crecer cuidándola de la contaminación del medio, no aplicarse ningún tratamiento por al menos 15 días y presentarse con zapatos cerrados. Estas indicaciones nos permiten conseguir la muestra lo más homogénea y con menor cantidad de contaminantes posible. Otro aspecto a considerar es que previo a la toma de la muestra se debe limpiar con alcohol al 70 % la zona utilizando algodón o gasa. Los implementos de toma de muestra deben estar previamente esterilizados (38,39). 1.4.2. Examen directo. El examen directo consiste en la observación de la muestra obtenida sumergida en una solución de KOH al 40 %. Éste se realiza utilizando un portaobjetos y un cubreobjetos. En el examen directo se busca la presencia de estructuras fúngicas. Estas estructuras pueden ser: micelio hialino septado, micelio artrosporado, blastosporas y/o micelio fuliginoso. Otra herramienta diagnóstica son las biopsias de uña donde la tinción de PAS (Tinción de ácido peryódico de Schiff) nos permite una visualización de las estructuras fúngicas tiñendo estructuras con polisacáridos y mucopolisacáridos (elementos presentes en la pared celular de los hongos). El examen directo no nos permite identificar las especies fúngicas involucrada en la enfermedad. Para esto se requiere la realización de un cultivo (15,38). Existen otras tinciones y fluorocromos que facilitan la observación de las muestras en micología médica y son un complemento al examen directo con KOH. El blanco de calcoflúor, por ejemplo, es un fluorocromo que se une a los enlaces 1,3 y 1,4 de los 16 polisacáridos. En el caso de los hongos se une a la quitina (N-acetil-glucosamida) de la pared celular. Al exponerse a la luz ultravioleta permite estudiar la morfología de cultivos y exámenes directos. Esto es especialmente útil cuando los elementos fúngicos son escasos. Se debe mezclar previamente con KOH para la observación de la muestra. Otra tinción complementaria es el azul de metileno que es un colorante que tiñe el citoplasma de los hongos, utilizado para observar muestras clínicas. La tinta negra de Parker 51 también se utiliza con el KOH en la observación de exámenes directos, esta tiñe el citoplasma de los hongos haciéndolos visibles en la preparación (38). 1.4.3. Cultivo. El cultivo, por otro lado, nos permite identificar la especie fúngica involucrada en la lesión. Esta técnica ha demostrado tener una alta especificidad (entre el 88 y el 100 %) (2). Sin embargo, presentan una baja sensibilidad (entre el 60 y el 65 %) (40). Se utilizan medios como Sabouraud dextrosa y medios adicionados con cicloheximida que inhibe el crecimiento de algunas especies fúngicas. Además, se adiciona gentamicina y cloranfenicol para inhibir el crecimiento de bacterias (40,41). La cantidad de muestra debe ser adecuada para mejorar la sensibilidad y se debe evitar el uso de tratamientos previo a la toma de muestra por al menos 15 días porque estos generan falsos negativos (42). Los cultivos suelen durar de dos a cuatro semanas dependiendo de velocidad del crecimiento de las diferentes especies fúngicas (40). Los medios de cultivo inoculados deben ser incubados a una temperatura entre los 25 y 30 °C, se deben revisar periódicamente por tres a cuatro semanas y deben sellarse para evitar el ingreso de contaminantes, esto se logra mediante papel Parafilm® (9,24,38,43). En el diagnóstico de las onicomicosis es importante distinguir entre los organismos contaminantes ambientales y los agentes causales del cuadro clínico. En 1976, Walsh & English, establecieron una serie de criterios para lograr diferenciar los hongos que realmente están creciendo en la uña. Los criterios son los siguientes: si se aísla un dermatofito, se toma como el patógeno sin importar otro crecimiento en el cultivo. Si se aísla una levadura, solo 17 se toma como el patógeno si la estructura apropiada es visible en el examen directo. Para el diagnóstico de HFND se deben contar al menos 5 de 20 inóculos positivos por el hongo y presentar un examen directo positivo (44). Existen diversos métodos de identificación de especies fúngicas en el cultivo. Algunos hongos son identificables mediante microscopía, utilizando azul de lactofenol para hongos hialinos y lactofenol claro para hongos fuliginosos. En el caso de las levaduras existen diversos métodos de identificación mediante bioquímica como el VITEK® y el API®. Que mediante paneles de reacciones bioquímicas son capaces de identificar especies de levaduras por género e incluso algunas por especie o por complejo (45,46). Además, existen agares que mediante generación de reacciones de color en agares cromogénicos permiten identificar ciertas especies de levaduras del género Candida como el CHROMoagar® (47). La espectrometría de masas “matrix-assisted laser desorption ionization time-of- fligh“ (MALDI-TOF), permite la identificación de especies tanto de levaduras como de hongos filamentosos mediante la generación de espectros a partir de iones de moléculas orgánicas, por lo general proteínas ribosomales, en su fase gaseosa. Estos separados en su masa y su carga (48). Finalmente, las pruebas de biología molecular como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en tiempo real o una combinación entre PCR y secuenciación de polimorfismos de restricción (RFLP) nos permiten detectar y diferenciar agentes de onicomicosis en muestras de biopsia o queratina. No presentan altas tasas de falsos negativos y son de gran utilidad por la rapidez y sensibilidad del diagnóstico (24). Estas pruebas tienen la desventaja de su alto costo y la necesidad de correlacionar el resultado de la prueba molecular con la clínica del paciente y el cultivo. Uno de los kits presentes en el mercado es el EUROArray Dermatomicosis® que nos permite la detección de más de 50 dermatofitos. Además, permite identificar seis hongos levaduriformes. Ayuda a la detección de infecciones múltiples e infecciones por dermatofitos difíciles de cultivar, los hongos que detecta la prueba están especificados en el anexo 1 (49,50). 18 1.4.1.- Técnicas alternativas de diagnóstico. Existen diversos métodos alternativos al examen directo y cultivo que permiten el diagnóstico de onicomicosis. Entre ellos se encuentran: dermatoscopía digital, miscroscopía confocal laser, test de dermatofitos por tira, microscopía de fluorescencia y espectroscopia de Raman (15). La dermatoscopía digital permite de manera rápida y fácil distinguir las onicomicosis de distrofias comunes de las uñas (15) La microscopía confocal láser permite observar a los dermatofitos como una serie de estructuras de alta reflexión y la forma típica de una hifa (51). El test de dermatofitos es un test inmunocromatográfico por tira, diseñado para detectar antígenos de dermatofitos en muestras de uñas. Utiliza un anticuerpo monoclonal que reacciona con las especies de Trichophyton, con una duración de 15 minutos. Es fácil, barato y rápido. Presenta una alta sensibilidad y valor predictivo negativo. Este análisis reporta un 98 % de sensibilidad, 78 % de especificidad, 84.8 % de valor predictivo positivo, 97 % de valor predictivo negativo y requiere una muestra mínima de (0.002-0.722) mg (52). La microscopía de fluorescencia puede ser utilizada en la examinación de uñas con sospecha de onicomicosis teñidas con PAS. La observación de estructuras fúngicas mediante microscopía de fluorescencia fue anteriormente probada con la tinción de hematoxilina eosina. Se ha demostrado que en muestras de onicomicosis teñidas con PAS (que generalmente se observan con microscopía de luz) las estructuras se observan de manera tubular o anular rodeadas de fluorescencia, esta técnica presenta una sensibilidad del 96 % y una especificidad del 90 %. No permite distinguir entre especies o micelio vivo o muerto (53). La espectroscopia de Raman es una técnica vibracional que permite estudiar la composición de muestras basadas en espectros. Se basa en la dispersión inelástica de luz monocromática. Los fotones de una luz monocromática interacturan con la muestra Los mismos son absorbidos por la muestra y reemitidos. La frecuencia de los fotones son reemitidos se desplaza hacia arriba o hacia abajo en comparación con la frecuencia original 19 generando información sobre transiciones vibracionales, rotacionales y de baja frecuencia de las moléculas (54). Permite la investigación de la composición molecular basada en la especificidad de bandas en un espectro vibracional. La especificidad molecular permite diferenciar entre las diferentes especies de hongos dermatofitos y no dermatofitos. En la literatura solo se reportan resultados preliminares (53). 1.5. Epidemiología de las onicomicosis. Se estima le prevalencia en la población occidental entre un 2-3 % hasta un 13 %. Existen diversos factores que afectan esta prevalencia. Entre los que destacan: edad, ocupación, frecuencia de viajes, clase social y factores de riesgo. Se observa de manera más prevalente en pacientes HIV positivo. Los riesgos de presentar una onicomicosis aumentan con la edad, porque aumentan los factores de riesgo como: mala circulación en la extremidad, diabetes, mucha exposición a agentes etiológicos, múltiples traumas en uñas, sistema inmune no óptimo e imposibilidad de mantener una buena salud de los pies. En niños hay una menor prevalencia de onicomicosis con respecto a adultos. Entre los factores que podrían incidir en esta baja prevalencia están: poca exposición a los agentes, crecimiento acelerado de las uñas y poca superficie de la uña (2,3,55–57). 1.6. Tratamiento. El tratamiento de las onicomicosis se puede dar por vía oral o tópica, siendo el tratamiento oral (sistémico) el más recomendado. Cuando no es posible la administración de un tratamiento sistémico se puede recurrir a tratamientos paliativos como extracción de secciones de la uña infectada de manera parcial o total (58). La literatura menciona la importancia de considerar diversos factores antes de iniciar el tratamiento. Entre ellos: el microorganismo aislado, la gravedad de las lesiones, medicamentos que consume el paciente, 20 su edad, las enfermedades concomitantes, la localización de las lesiones, la cantidad de uñas infectadas y la preferencia del tratamiento por parte del paciente, entre otros (59–61). Existen descripciones de criterios para determinar la curación del padecimiento, a seis meses de la finalización del tratamiento. Estos son: ausencia de signos clínicos y examen fúngico negativo (cultivo o examen directo). Se comenta además que a pesar de que generalmente la apariencia de la uña mejora posterior al tratamiento en algunas ocasiones se siguen viendo anormalidades a pesar de que el tratamiento fue efectivo (62). El uso de una confirmación de laboratorio es importante para evitar diagnósticos erróneos (63). Los medicamentos utilizados para el tratamiento de las onicomicosis usualmente presentan hepatotoxicidad y otros efectos secundarios a los cuales se vería expuesto el paciente sin necesidad si el diagnóstico de la onicomicosis es erróneo (64). Se abordarán los tratamientos en cinco grupos: antifúngicos orales, antifúngicos tópicos, terapias láser, terapia fotodinámica y tratamientos misceláneos. 1.6.1. Antifúngicos tópicos. 1.6.1.1. Pomada con urea al 40 %. Tiene la capacidad higroscópica de ablandar la uña. Se emplean curas oclusivas por cuatro a cinco semanas, posterior esto se remueven las áreas afectadas de la uña mediante un procedimiento no quirúrgico sin requerir anestesia local (65). La técnica anterior se denomina avulsión de la uña y se indica en cuatro ocasiones: se presenta hiperqueratosis subungueal con 3 mm o más de espesor, hay una invasión lateral subungueal, el examen directo detecta dermatofitomas y cuando se presentan onicolisis muy profundas como en onicomicosis por HFND (66). Existen otros agentes queratolíticos como el ácido salicílico, el ácido láctico y la papaína (66). La pomada con urea al 40 % puede venir acompañada de bifonazol al 2 %, yoduro de potasio al 50 % o ácido salicílico al 10 % (65). Esta técnica puede producir la caída 21 espontánea de parte de la uña y después de las cuatro semanas se extrae la mayor parte de la uña afectada con alicates. Se evitan 3 mm antes de la matriz para evitar una nueva uña con crecimiento anárquico (66). En el lecho subungueal posterior al recorte de la uña se recomienda aplicar antifúngicos locales como terbinafina, azoles o ciclopirox olamina (66). 1.6.1.2. Laca de ciclopirox olamina al 8 %. Forma farmacéutica que permite el paso transungueal del antifúngico de amplio espectro. Presenta eficacia contra hongos productores de infecciones fúngicas de la piel y sus anexos, además, de acción antibacteriana. Es un compuesto de inhibe enzimas importantes en la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos (66). Se aplica como un barniz en la uña, posterior a limar la misma. Se realiza una vez por día durante 48 semanas. Se indica para onicomicosis en manos en conjunto con antifúngicos orales (67). Se puede utilizar como tratamiento único, si la afectación no supera el 30 %. Sin embargo, se estima una eficacia inferior al 50 % en onicomicosis en manos e inferior al 25 % en onicomicosis en pies (66). 1.6.1.3. Laca de amorolfina al 5 %. Forma farmacéutica que permite el transporte transungueal del derivado morfolínico. Tiene eficacia contra dermatofitos, HFND y levaduras. Presenta acción fungistática mediante la inhibición de la síntesis de ergosterol, inhibiendo la 14- α-reductasa y la 7,8- α-isomerasa. Se aplica una o dos veces por semana por seis meses. Es similar a la laca de ciclopirox en términos de indicaciones(65–67). 1.6.1.4. Solución alcohólica de tioconazol al 28 % con ácido undecilínico. Se utiliza en onicomicosis leves, con menos del 15-20 % de la uña con afectación, presenta porcentajes de curación bajos. Por lo general se recomienda ante la imposibilidad de la utilización de medicamentos sistémicos (68). 22 1.6.2. Antifúngicos orales. 1.6.2.1. Fluconazol. Es un antifúngico fungistático que inhibe la lanosterol 14-α-desmetilasa una enzima citocromo P-450 dependiente que cataliza la conversión de lanosterol a ergosterol. El ergosterol es parte crítica de la membrana celular fúngica, al inhibir la formación del mismo, se aumenta la permeabilidad celular (69). Se considera un antifúngico de amplio espectro. Presenta una alta actividad contra levaduras, una actividad disminuida contra dermatofitos y no presenta actividad contra los HFND (66). Este antifúngico se detecta en uñas a los pocos días de iniciado el tratamiento y al suspenderlo los niveles útiles se mantienen por un mes (40). Presenta altos índices de recidivas al año posterior a la finalización del tratamiento y la dosis sugerida es de 300 a 450 mg por semana durante 6 a 9 meses (40). Este medicamento presenta menos efectos colaterales (daño hepático e interacción con otras drogas) con respecto a itraconazol y terbinafina esto debido a su menor metabolización hepática. Se indica principalmente en personas que consumen distintos medicamentos, especialmente pacientes adultos mayores (66). 1.6.2.2. Itraconazol. Es un antifúngico fungistático que, al igual que el fluconazol inhibe la enzima lanosterol 14-α-desmetilasa dependiente del citocromo P-450. Se absorbe mediante vía digestiva, es dependiente del pH ácido del estómago (se recomienda ingerir con alimentos ácidos) y la presencia de alimentos lipídicos (70). Es un antifúngico del amplio espectro, actúa sobre levaduras, dermatofitos y variedad de HFND (70). Presenta una difusión a piel mediante vasos sanguíneos y sebo cutáneo. Se detecta en uñas a la semana del inicio del tratamiento y al suspenderlo los niveles útiles se mantienen entre seis a nueve meses. Se elimina un 40 % en orina y el resto en heces. Presenta alta 23 interacción con otros medicamentos y se recomienda la realización de pruebas hepáticas así como un historial de medicamentos de metabolización hepática previos a la administración de la droga (40,66). La dosis recomendada es de 200 mg por día después de un tiempo de comida por tres a cuatro meses para onicomicosis en pies y la mitad para manos. Otra opción es la administración en pulsos con dos tomas diarias de 200 mg después de las comidas. Una semana de cada mes por tres a cuatro meses. Presenta frecuentes recidivas y una eficacia clínica entre el 60 y el 70 % de los pacientes (66). 1.6.2.3. Terbinafina. Es un medicamento altamente utilizado para el tratamiento de onicomicosis causadas por dermatofitos. Es un tratamiento fungistático para levaduras y HFND y fungicida contra dermatofitos (71). Funciona mediante la inhibición de la formación del ergosterol. Es una alilamina que funciona como un inhibidor no competitivo de la escualeno epoxidasa. La enzima anterior convierte el escualeno a lanosterol. La acumulación de este compuesto genera muerte celular (71). Su eficacia, a diferencia del itraconazol, no se ve afectada por el consumo de neutralizantes de la acidez gástrica (71). Se detecta en uñas a los siete días de iniciado el tratamiento. Tiene características altamente queratinolítica y lipofílica. Al terminar el tratamiento se detecta a los 60 días en uñas. Se metaboliza por el citocromo P450. Se excreta principalmente en orina y 15 % en bilis (66,71). Presenta menos adherencia al citocromo P450 y menor interacción con otras drogas con respecto al itraconazol y está contraindicado en el embarazo (40,66). Se indica en dosis de 250 mg una vez al día por dos meses en onicomicosis en manos y 3 a 4 meses en onicomicosis en pies. También existen dosis en pulso donde se administran 500 mg al día una semana al mes por tres a cuatro meses para onicomicosis en pies y la mitad del tiempo si es en manos (66). 24 1.6.2.4. Combinación de antifúngicos. Se han estudiado combinaciones de diferentes antifúngicos orales para el tratamiento de las onicomicosis. Entre ellos la combinación de itraconazol y terbinafina que ha demostrado un efecto sinérgico en el tratamiento contra N. dimidiatum (72). Esta combinación ha sido estudiada con resultados favorables además en otros HFND y en dermatofitos (73). Otras combinaciones como la combinación de ciclopirox olamina con itraconazol o terbinafina obtuvieron resultados favorables. Lograron mejorar la clínica de los pacientes y reducir el tiempo de tratamiento (73). Resultados similares a la combinación de laca de amorolfina con itraconazol o terbinafina (73). 1.6.3. Terapias láser. Tienen como principio la fototermólisis selectiva, la energía del láser es preferencialmente absorbida por los hongos generando altas temperaturas y muerte de los mismos. Es un tratamiento prometedor, pero todavía no se ha generado suficiente información para considerarlo eficaz (74). Es un tratamiento dirigido con pocos eventos adversos. La longitud de onda va entre los 750 y 1300 nm para penetrar la uña. Los estudios han demostrado que los láseres son efectivos en resultados cosméticos de las uñas pero no presentan eficacia (comparados con tratamientos orales o tópicos con antifúngicos) en curación de la infección micótica (75). Las terapias laser son seguras y se pueden considerar en pacientes a los que no se le puedan aplicar terapias antifúngicas o como parte de una terapia combinada (76). 1.6.4. Terapia fotodinámica. Las terapias fotodinámicas incluyen fotoactivación de un fotosensibilizador a una longitud de onda específica. La fotoactivación tiene como objetivo incrementar los niveles energéticos del fotosenbilizador. La energía generada reacciona con el oxígeno del tejido 25 generando especies reactivas de oxígeno y radicales libres citotóxicos. Los hongos absorben el fotosensibilizador haciéndolos más susceptibles a la necrosis que los tejidos adyacentes (77). No existe información a gran escala con datos sólidos que demuestren la eficacia de esta técnica, solo estudios que incluyen pocos pacientes y demuestran que puede en algunos casos ser beneficioso en el tratamiento de las onicomicosis (63). 1.6.5. Tratamientos misceláneos. La remoción mecánica de la uña es un tratamiento efectivo para las onicomicosis blancas superficiales, no se recomienda en todos los casos por ser doloroso, requerir anestesia y en ocasiones daña el lecho ungueal generando un crecimiento no deseable de la uña. Se menciona que debe ser seguida de una terapia antifúngica para reducir la carga (66). Al utilizar un tratamiento antimicótico se recomienda siempre la abrasión del hongo mediante limas o removiendo las áreas afectadas para mejorar la penetración del antifúngico (63). La iontoforesis La iontoforesis es el envío de concentraciones terapéuticas de una droga mediante la aplicación de una corriente o carga eléctrica puede ayudar a penetrar al tratamiento antifúngico en el lecho ungueal (78). Se puede experimentar una sensación de cosquillas con la aplicación actual. Se deben realizar estudios para determinar la eficacia y la seguridad de la iontoforesis en el tratamiento de las onicomicosis (63). 26 2. METODOLOGIA 2.1 Diseño de investigación. 2.1.1 Revisión bibliográfica. Se realizó una revisión bibliográfica sobre las generalidades de las onicomicosis. Se consultó las bases de datos suscritas al Sistema de Bibliotecas Documentación e Información (SIBDI) de la Universidad de Costa Rica, American Society for Microbiology (ASM Journals), Clinical Key, Kérwá, Kímuk, NCBI, ProQuest, Springer, Scielo, SAGE journals, Ovid, Uptodate y revistas como International Journal of Microbiology, Nature, Science, Mycophatologia, Mycoses, entre otras; en busca de artículos científicos y literatura especializada que aborde el tema de onicomicosis. Las palabras clave utilizadas como referencia fueron las siguientes: Onicomicosis, Trichophyton rubrum, Candida albicans, Candida, Fusarium, Aspergillus, Scopulariopsis, Nannizzia gypsea, Microsporum, Epidermophyton floccosum, Trichophyton tonsurans, infecciones superficiales, micosis superficiales, hongos filamentosos no dermatofitos. Las palabras claves se consultaron tanto en idioma español como inglés. 2.1.2 Revisión de datos de laboratorio. Se realizó un estudio retrospectivo de los expedientes de los pacientes que consultaron por onicomicosis en un laboratorio privado de Costa Rica, ubicado en una zona urbana del Cantón Central de San José entre marzo 2022 a julio 2023. Se analizaron los datos de sexo, edad, resultado del examen directo y el cultivo. Para los datos epidemiológicos se determinaron los promedios de edades y porcentajes de positividad según sexo para realizar un análisis estadístico (chi cuadrado) utilizando el software IBM® SPSS® y buscar correlaciones. En el caso de las edades se agruparon en grupos de 10 años para visualizar la tendencia y se realizó un promedio de estas. 27 Se abordó de manera retrospectiva la información recopilada de expedientes de los pacientes en estudio y se discutió la información dando a conocer aspectos epidemiológicos y microbiológicos, mas no su causalidad. 2.2. Criterios de inclusión. Pacientes que se presentaron al laboratorio clínico privado en estudio entre marzo 2022 y julio 2023 con sospecha de onicomicosis. 2.3 Criterios de exclusión. Pacientes que se presentaron al laboratorio privado en estudio por cualquier otra sospecha de lesión fúngica diferente a una onicomicosis. 2.4 Permisos. Se solicitó el permiso a la dirección de calidad del laboratorio clínico privado para el uso de los datos de los pacientes con todas las consideraciones de éticas. Las personas involucradas en la realización del estudio (autor, tutora y lectoras) poseen el título de “Buenas Prácticas de Investigación Clínica”. Además, el investigador principal presenta el certificado de autorización como investigadores observacionales otorgado por el Consejo Nacional de Investigación en Salud (CONIS) (ver Anexo 2). Además, se solicitó el permiso del Comité Ético Científico de la Universidad de Costa Rica (Ver anexo 3), el cual fue otorgado mediante el oficio CEC-797-2024. Además Se solicitó una exención del uso de consentimiento informado, otorgado por el Comité Ético de la Universidad de Costa Rica (Anexo 3). Se solicitó la inscripción en el Consejo Nacional De Investigaciones en Salud de conformidad con los artículos 44 al 48 y 60 del reglamento a la Ley No. 9234 “Ley Reguladora de Investigación Biomédica” del 22 de abril de 2014 publicado en La Gaceta No. 79 del 25 de abril de 2014. 28 2.5 Codificación de los datos. Los datos se tomaron de la información presente en el sistema informático utilizado por el laboratorio para el manejo de los mismo y del registro físico del registro del laboratorio (libro de actas). Se les asignó un número a las muestras y se eliminó cualquier información personal de los pacientes (Nombre, número de cédula). Se generó una base de datos anonimizada en el sistema Excel. 29 3. RESULTADOS 3.1. Información general de los pacientes en estudio. Se realizó un estudio retrospectivo de los expedientes de un laboratorio clínico privado entre marzo 2022 y julio 2023. El laboratorio se ubica en una región urbana, en el Cantón Central de San José. Se atendieron 177 pacientes con sospecha de onicomicosis. A todos los pacientes se les realizó el examen directo y los cultivos por hongos según el protocolo de toma de muestra y procesamiento de micosis superficiales del laboratorio en estudio denominado ̈ LE-RA-I10¨ (Anexo 4). De los 177 pacientes 99 (55.9 %) corresponden al sexo femenino y 78 (44.1 %) al sexo masculino y presentaban un rango de edades de 7 a 84 años (promedio de 48 ± 15.92 años). Para analizar la edad de los pacientes se separaron en grupos de 10 años. La mayoría de los pacientes que presentaron cultivos positivos se encontraban entre los 30 y los 70 años. La distribución etaria de los pacientes se presenta en la Figura 9. Figura 9. Distribución etaria de los pacientes atendidos por sospecha de onicomicosis en un laboratorio clínico privado de Costa Rica. (n = 177). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 - 10 11 - 20 21 - 30 31 - 40 41 - 50 61 - 70 71 - 80 81 - 90 91 - 100 Ca nt id ad d e pa ci en te s Edad (años) 30 No se encontró relación entre el sexo y la tasa de positividad en la prueba (p > 0.05). Los pacientes incluidos en el estudio residen, principalmente, en la provincia de San José (n = 90, 61.6 %), el resto provenían de las otras provincias que conformar el Gran Área Metropolitana: 28 (19.2 %) de Heredia, 22 (15.1 %) de Alajuela, y 4 (2.7 %) de Cartago. Los restantes 2 (1.4 %) provenían de la Provincia de Guanacaste. 3.2. Información microbiológica de las muestras en estudio. De las muestras procesadas, 146 estaban positivas ya sea por examen directo y/o por cultivo (82.5 %). De estas muestras positivas 135 (92.5 %) fueron positivas por examen directo y cultivo y 11 (7.5 %) solo por examen directo. No se obtuvieron muestras positivas por cultivo cuyo examen directo fuera negativo. Para la identificación del cultivo se utilizó, en el caso de hongos miceliales, la identificación de estructuras mediante microscopía y para los hongos levaduriformes el sistema automatizado VITEK® con la tarjeta VITEK2 YST®. De las muestras positivas, 145 (99.3 %) eran muestras de onicomicosis en pie y las restantes era de manos. En esta última se observó al examen directo micelio hialino septado y blastosporas y se logró identificar una C. parapsilosis. En el cuadro 1 se presenta la distribución de los tipos de estructuras fúngicas observadas en los exámenes directos. Cuadro 1. Estructuras observadas en el examen directo. Estructura observada Número de muestras Blastosporas 2 Micelio hialino septado 103 Micelio artrosporado 18 Micelio hialino septado y micelio artrosporado 22 Micelio hialino septado y blastosporas 1 31 De las muestras positivas por cultivo (n = 135), 87 (64.4 %) correspondían a dermatofitos, 27 (20.0 %) a levaduras, 16 (11.9 %) a HFND y 5 (3.7 %) a infecciones mixtas por dos hongos. La distribución de las especies aisladas se observa en el siguiente cuadro. Cuadro 2. Microorganismos aislados a partir de las onicomicosis diagnosticas en un laboratorio clínico privado de marzo 2022 a julio 2023. Análisis de laboratorio Número de muestras Agente aislado (n) Cultivo y examen directo positivo. 135 T. rubrum 79 T. tonsurans 7 E. floccosum 1 Acremonium sp 2 Fusarium sp 9 N. dimidiatum 4 C. albicans 8 C. duobushaemulonii 3 C. famata (T. candida) 1 C. haemulonii 2 C. haemulonii var vulnera 1 C. parapsilosis 11 T. asahii 1 Cultivo negativo y examen directo positivo. 11 NA Por otro lado, los pacientes que estaban infectados por más de un patógeno fúngico a la vez, presentaron una infección mixta T. rubrum y Fusarium sp. (n = 2), Candida duobushaemulonii y T. rubrum (n = 1), Fusarium sp. y C. albicans (n = 1) y T. asahii y Fusarium sp. (n = 1) (Figura 10). 32 Figura 10. A y B. Infección mixta por Fusarium sp. y T. rubrum, vista macroscópica. C y D. Infección mixta por Fusarium sp. y T. rubrum, vista microscópica. E. Infección mixta por C. duobushaemulonii y T. rubrum vista macroscópica. F. Infección mixta por C. albicans y Fusarium sp. vista macroscópica. 33 4. DISCUSION. Las onicomicosis muy frecuentemente son vistas como un tema estético. Sin embargo, son un problema que afecta diversos factores en la calidad de vida en aspectos físicos, fisiológicos, psicosociales, ocupacionales, entre otros. Es muy importante el diagnóstico certero para lograr brindar una atención correcta al paciente y mejorar su calidad de vida (11). Diversas investigaciones indican que la edad promedio de los pacientes diagnosticados con onicomicosis ronda los 49 años (2,3,7,19). El promedio de edad de los pacientes positivos por onicomicosis (cultivo, examen directo o ambos) del presente estudio concuerdan con lo reportado en la literatura al presentar un promedio de 48 años. A pesar de que sí se presentan onicomicosis en niños, diversos factores de riesgo (discutidos en la sección 1.5) asociados a la edad generan que la mayoría de los casos se reporten entre los (40-60) años. A partir de los sesenta se considera la poca motivación de los pacientes de ser diagnosticados como un factor para la disminución en los casos a partir de esa edad (8,11). Diversas investigaciones indican que el sexo femenino consulta con más frecuencia por onicomicosis que el sexo masculino. Estos estudios indican que las mujeres son más conscientes de aspectos estéticos y de salud que los hombres(2,3,11,55). En el presente estudio se coincide con esta información donde el 55.9 % de los pacientes eran del sexo femenino. A pesar de esto, en el análisis epidemiológico no encontró relación entre el sexo y la presencia de onicomicosis. Con respecto a la prevalencia de onicomicosis en pacientes con alteraciones en las uñas, en diferentes países, los porcentajes de positividad varían entre un 28 % y un 84 % en las bibliografías consultadas (3,4,7,55–57,79–84). Según la literatura, las diferencias en las prevalencias se pueden ver afectadas por condiciones climáticas, de hábitos, clínicas y geográficas que favorecen la aparición de las onicomicosis. Entre ellas: eltipo de calzado, el clima tropical, las actividades deportivas, los traumas recurrentes, las enfermedades crónicas como diabetes, la exposición a la humedad y el estado del sistema inmune (57,85). Por otro lado, el porcentaje de positividad de los cultivos también varía según el país, reportándose un 28 % en Grecia (82)48 % en China (57) y en Canadá (81),52 % en Costa 34 Rica (7) y Brasil (56), 60 % en Etiopía (80), 61 % en Argentina (3) y Chile (83), y 84 % en Paraguay (55). En el presente estudio se reportó una positividad del 76 %, comparable a lo reportado en Paraguay y superior a los otros estudios analizados. Con respecto al examen directo, éste es parte fundamental del diagnóstico de las onicomicosis. Es un acercamiento sencillo y rápido que nos ayuda a determinar la presencia de una onicomicosis y correlacionar las estructuras con el resultado del cultivo. Por ejemplo, si se observa micelio artrosporado en el examen directo se sabe que al menos uno de los agentes causantes o el agente causante de la onicomicosis es un dermatofito. En el caso de los HFND, el examen directo es fundamental para correlacionar al agente aislado con la clínica. Se establece según criterios de la literatura que para reportar un HFND como agente causal se debe tener estrictamente el examen directo positivo, entre otros criterios establecidos en el punto 6 del LE-RA-I10 (ver anexo 4). De los resultados obtenidos, en 11 pacientes con exámenes directos positivos no fue posible aislar al microorganismo mediante la técnica de cultivo. Por otro lado, ninguno de los cultivos positivos presentó un examen directo negativo. Según la literatura, la sensibilidad del examen directo con respecto al cultivo es alta (84 %). El punto débil del examen directo es la especificidad que suele ser baja ya que esta prueba no nos permite identificar especies (9), por ende, ambas técnicas son complementarias y fundamentales para el correcto diagnóstico micológico. Otra ventaja del examen directo es que ayuda para predecir el éxito del cultivo y la calidad de la muestra. Si se observan gran cantidad de estructuras fúngicas, se puede predecir que el cultivo será exitoso. En cambio, una muestra pobre, poco homogénea, donde se observan muy pocas estructuras fúngicas o ninguna, es más probable desencadene un resultado negativo o falso negativo (10). Si se observan estructuras fúngicas morfología alterada, se puede considerar la posibilidad de que en el proceso pre-analítico el paciente pudo haber aplicado algún tipo de tratamiento afectando el proceso de diagnóstico. El examen directo se ve afectado por la experiencia en el montaje y observación de estructuras de la persona que la realice. Representa una gran utilidad en la práctica clínica y debe ser complementada con el cultivo (10). Incluso algunos autores determinan el examen directo como la mejor metodología para el diagnóstico de onicomicosis, esto por ser fácil de realizar 35 y presentar menos falsos negativos (43). Se considera la necesidad de realizar ambas pruebas para un mejor diagnóstico. Más que una ser mejor que la otra, son pruebas complementarias. Con respecto al cultivo, éste es el estándar de oro en el diagnóstico de onicomicosis, porque nos permite determinar la especie involucrada en el cuadro clínico. El cultivo nos permite identificar al agente etiológico, generar datos epidemiológicos y orientar el tratamiento del paciente (43). Los cultivos en el presente trabajo nos permitieron identificar diversas especies de hongos en las muestras en estudio. El 87 % de las muestras correspondieron a dermatofitos, esto concuerda con la literatura donde se indica que este grupo de organismos corresponden a los principales agentes causales de onicomicosis a nivel mundial. De los dermatofitos aislados, además, T. rubrum fue la especie que más se aisló, lo cual también coincide con la literatura que indica que este agente es el principal hongo causante de onicomicosis a nivel mundial (6,15,19,59,62,63,86) En el laboratorio clínico el diagnóstico de las onicomicosis requiere una serie de procedimientos de estandarización para mejorar la sensibilidad y especificidad de los cultivos y exámenes directos. En el laboratorio en estudio se realizaron los procedimientos según el protocolo LE-RA-I10 (ver Anexo 4). El protocolo establece una serie de indicaciones con respecto a los procedimientos pre-analíticos, analíticos y post-analíticos. Por ejemplo, entre los procedimientos pre-analíticos se le solicita al paciente no aplicarse ningún tipo de tratamiento (talcos, cremas spray, remedios caseros) ni esmalte o brillo al menos por dos semanas antes de la toma de muestra, traer zapatos cerrados a la toma de muestra, lavarse únicamente con agua y jabón y traer la uña sin recortar, lo más larga posible. Para la toma de la muestra, este manual enlista los instrumentos, reactivos y medios de cultivo que se deben utilizar, como estilete acanalado, KOH al 40 % y agar Sabouraud dextrosa y Mycosel®, respectivamente. Finalmente, indica las distintas opciones de reporte. En el laboratorio clínico privado es fundamental la colaboración entre los podólogos y médicos que refieren a los pacientes y el laboratorio. En el presente trabajo, la mayoría de los pacientes referidos por los mismos tiene altas sospechas de onicomicosis, esto se puede ver reflejado en el alto porcentaje de positividad del cultivo donde el 76 % de los mismos dieron positivos comparados con otros datos de la literatura donde rondan entre el 50 y el 60 % (6,15,19,59,62,63,86). 36 Continuando con los resultados de los cultivos, diversos estudios indican que las especies de Candida son importante agentes etiológicos de onicomicosis. Esto principalmente en uñas de manos, pero también en pies (87). En el presente estudio la levadura más aislada fue C. parapsilosis (n = 11; diez de uñas de pies y uno de uñas de manos). Esto representa en 40.7 % de los aislamientos por hongos levaduriformes. Seguido de ocho aislamientos de C. albicans (33.3 % de los aislamientos de este grupo). Es importante resaltar que, diversos estudios afirman que entre el 1 y el 32 % de las onicomicosis en pies son causadas por levaduras (88) Sin embargo, algunos autores consideran que, cuando se observa el crecimiento de un dermatofito y un hongo levaduriforme juntos, se debe ignorar al segundo y solo reportar al primero (44). Lamentablemente, este tipo de prácticas disminuye el reporte de infecciones mixtas (crecimiento de la Candida luego del daño causado por el dermatofito) y como se desarrolla en el párrafo siguiente, esto conlleva a fallas terapéuticas. A pesar de que las levaduras no son hongos queratinolíticos, se considera que pueden ser patógenos oportunistas en pacientes con uñas alteradas generando onicólisis distal y paroniquia crónica (89). Esto es relevante a nivel del tratamiento por la reportada resistencia de las levaduras a la terbinafina (el 65.8 % de los aislamientos en un estudio presentaron resistencia en un estudio en aislamientos de Candida de pacientes oncológicos), este medicamento es altamente utilizado en pacientes con onicomicosis por dermatofitos (32,33,87,90) Por otro lado, en el presente trabajo se aislaron agentes como Fusarium sp. y N. dimidiatum. Estas especies no responden al tratamiento convencional utilizado en las onicomicosis (60). Incluso para el caso de N. dimidiatum no se ha descrito una terapia efectiva para el tratamiento de este (72). Por tanto, es de suma importancia el correcto diagnóstico de estos y la investigación en posibles alternativas de tratamiento contra los mismos. Finalmente, diversos autores mencionan las limitaciones de los métodos convencionales (como Vitek®) que se basan en bioquímica para la identificación de especies crípticas como los complejos C. parapsilosis y C. haemulonii. Las técnicas mencionadas tienen la capacidad de reportar con seguridad Candida complejo parapsilosis y Complejo C. haemulonii, respectivamente. La diferenciación entre especies de estos complejos tiene una 37 gran importancia a nivel de factores de virulencia, epidemiología y resistencia a antifúngicos. Existen otras metodologías que nos permiten identificar las especies como lo es MALDI- TOF o secuenciación (91). Estas diferenciaciones son importantes. Por ejemplo, en la diferenciación de C. dubliniensis de C. albicans, esto por la resistencia del primero a fluconazol. En el presente trabajo se observó que el laboratorio clínico analizado reporta los resultados tal cual los presenta el VITEK®, es decir como especies y no como complejos. Por lo tanto, se considera importante la utilización de métodos como MALDI-TOF para lograr determinar la especie involucrada en estos casos especialmente en levaduras poco comunes y especies crípticas y en micosis superficiales como las onicomicosis, se considera importante reportar las especies tomando en cuenta las limitaciones de la técnica y las recomendaciones del fabricante, si no es posible realizar la confirmación por otros métodos (91). 38 5. CONCLUSIONES. • Las onicomicosis son padecimientos que representan un reto en el diagnóstico en el laboratorio clínico. La generación de información con respecto a el comportamiento de las especies aisladas y la epidemiología de los pacientes nos permite mejorar el diagnóstico a los pacientes y plantearnos formas de estandarizar los procesos de toma de muestra y procesamiento de estas. • Los dermatofitos son los agentes etiológicos más aislados y estudiados en las onicomicosis. Estos hongos presentan características del examen directo y el cultivo que facilitan su diagnóstico. La utilización de medios con antibióticos como el MYCOSEL nos facilita la identificación de los mismos, esto por la inhibición que generan estos medios a agentes contaminantes como bacterias y hongos ambientales. • Se debe generar más información con respecto a los aislamientos de Candida en onicomicosis en uñas de los pies. Esto porque son frecuentes y hay debate con respecto a si deben ser reportadas o no, así como cuál es el impacto en el tratamiento de una onicomicosis de un HFND y un dermatofito junto con Candida. • La estandarización de procesos de toma de muestra y la buena comunicación con los profesionales tratantes de pacientes con onicomicosis puede influir positivamente en el diagnóstico efectivo de las mismas. • La presencia de aislamientos de HFND como Fusarium sp. y N. dimidiatum que no responden a tratamientos convencionales nos resalta la importancia del cultivo en el diagnóstico de las onicomicosis en el tratamiento de estas. 39 6. BIBLIOGRAFIA 1. Zaeimian Z, Fotouhifar KB. First report of Neoscytalidium dimidiatum as the causal agent of leaf blight on Clivia miniata. Sci Rep. 2023 Sep 26;13(1):16110. 2. Faergemann J, Baran R. Epidemiology, clinical presentation and diagnosis of onychomycosis. British Journal of Dermatology [Internet]. 2003 Sep 1;149(s65):1–4. 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Andrea Estevez-Angulo BI, Estefanía Carrillo-Terán MI, Andrea Gudiño-Villarreal III N, Stephanie Gálvez-Alarcón VI. Onicomicosis diagnóstico y tratamiento Onychomycosis diagnosis and treatment Onicomicose diagnóstico e tratamento Ciencias de la Salud Artículo de Investigación. 2022;7(6):1028–41. Available from: http://polodelconocimiento.com/ojs/index.php/es 86. Hoy NY, Leung AKC, Metelitsa AI, Adams S. New Concepts in Median Nail Dystrophy, Onychomycosis, and Hand, Foot, and Mouth Disease Nail Pathology. ISRN Dermatol. 2012 Jan 26;2012:1–5. 87. Vieille Oyarzo P, Cruz Choappa R. Onicomicosis por levaduras: agentes y estudio de sensibilidad en la región de Valparaíso, Chile. Rev Iberoam Micol. 2015 Apr;32(2):132–3. 88. Jayatilake JAMS, Tilakaratne WM, Panagoda GJ. Candidal onychomycosis: A Mini- Review. Mycopathologia. 2009 Oct 31;168(4):165–73. 89. García-Martos P, Domínguez I, Marín P, Mira J, Linares M, Calap J. 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JACQUELINE PERAZA VALVERDE PRESIDENTE SUPLENTE DEL CONIS 49 128-2024 Como Investigador (a) Principal Observacional Andrea Ruíz Mayorga 11 13 marzo 2024 13 marzo 2027 DR. JASON ROMAN RAMOS PRESIDENTE SUPLENTE DEL CONIS 50 Anexo 3. Aprobación por parte del Comité Ético Científico de la Universidad de Costa Rica 51 52 Anexo 4. LE-RA-I10 v2 Sección 4, 6, 7, 8 y 9 PROCEDIMIENTO DE TOMA DE MUESTRAS PARA ONICOMICOSIS 1 Instrucciones para el paciente 1. No aplicarse ningún tipo de tratamiento (talcos, cremas spray, remedios caseros) ni esmalte o brillo al menos por dos semanas antes de la toma de muestra. 2. Traer zapatos cerrados a la toma de muestra. 3. Lavarse únicamente con agua y jabón. 4. Traer la uña sin recortar, lo más larga posible. 2 Materiales para la toma de muestra 1. Placa de Petri estéril. 2. Agar Saburaud glucosado y Mycosel. 3. Cánula. 4. Cortaúñas 5. Tenaza de uña (Nipper) 6. Pinza. 7. Alcohol al 70%. 8. Papel toalla. 9. Bisturí estéril. 10. Mechero. 11. LE-RA-R05 Orden de Examen: para anotar observaciones referentes al paciente. 3 Procedimiento de toma de muestra de onicomicosis 1. Se llevan todos los materiales necesarios al espacio destinado a la toma de muestra. 2. Se realiza la esterilización de los implementos, utilizando el mechero. Realizarlo frente al paciente. Luego desinfectar los implementos con alcohol de 70%. 3. Se debe limpiar con abundante alcohol al 70% el área del paciente que está afectada. 4. Observar espacios interdigitales buscando otras zonas de aparente afectación por el hongo. En el caso de observar lesiones se realiza el raspado utilizando las instrucciones de la sección 5. 53 5. Se observan las lesiones y posterior a la toma de muestra se agrega la descripción y la ubicación de la lesión en la boleta del paciente como se indica en la sección 7. 6. En lesiones proximales, se realiza un raspado de los pliegues periungueales, utilizando el estilete acanalado o bisturí sin filo. 7. En