Artículo Rev. Chilena Ent. 2014, 39: 57-65 TERAPIA LARVAL CON LUCILIA EXIMIA (DIPTERA: CALLIPHORIDAE) DE COSTA RICA EN UN MODELO EXPERIMENTAL MAGGOT THERAPY WITH LUCILIA EXIMIA (DIPTERA: CALLIPHORIDAE) OF COSTA RICA IN AN EXPERIMENTAL MODEL Ólger Calderón-Arguedas1, 2, Kattia Belfort1, 2, Adriana Troyo1, 2 y María del Mar Gamboa1, 3 RESUMEN Con el fin de analizar la aceleración en la solución de heridas dérmicas mediante el trata- miento con larvas de Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae), se generaron úlceras en piel en parejas de ratas mediante inoculación subcutánea de veneno de Bothrops asper (4,7 mg/0,2 mL). En cada ensayo una rata fue sometida a terapia (rata de prueba) y la otra no (rata con- trol). Se probaron larvas de segundo estadio (L2) y larvas de tercer estadio temprano (L3). Los recambios larvales se hicieron cada 3 a 5 días hasta la solución de la úlcera. Se docu- mentó, en cada caso, cuál rata (prueba o control) resolvió primero. Se efectuaron 17 ensayos, 10 con L2 y 7 con L3. En 8 (47,0%), la rata de prueba solucionó la úlcera primero; en 7 (41,2%) hubo una solución simultánea y en 2 (11,8 %) la rata control solucionó primero. De acuerdo al estadio, al usar L2, el 50,0% de las ratas tratadas resolvió primero, mientras que cuando se emplearon L3, sólo un 42,0% lo hizo. El análisis estadístico no permitió eviden- ciar un efecto acelerador asociado con la terapia larval en el modelo implementado (c2=0,12; p=0,943; gl=2). En varios experimentos se observaron abscesos miásicos. El tipo de úlcera generado, de carácter agudo, pudo constituir una limitante en la evaluación de la terapia. El hallazgo de abscesos miásicos supone la necesidad mayor investigación antes de promover la idoneidad de L. eximia como agente para terapia larval. Palabras clave: Cicatrización de heridas, cuidados de la piel, desbridamiento, Diptera, lar- va, terapia biológica, úlcera. ABSTRACT In order to analyze the accelerating healing effect of the treatment of dermal wounds with maggots of Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae), skin ulcers were generated by subdermal inoculation of venom from Bothrops asper (4.7 mg/0.2 mL) on couples of rats. For each ex- periment one rat was treated (test rat) and the other was untreated (control rat). Second instar larvae (L2) and early third instar larvae (L3) were applied. The maggots were substituted each third to fifth day until the resolution of the ulcer. In each experiment, the rat that resol- ved the ulcer first (test or control) was documented. Seventeen experiments were performed, 10 utilizing L2 and 7 with L3. In 8 (47.0 %), the test rat resolved the ulcer first; in 7 (41.2 %) there was a simultaneous resolution, and in 2 assays (11.8 %) the control rat resolved first. According to the instar, when L2 were applied, 50.0 % of the treated rats resolved the ulcer before control, while only 42.0 % resolved the wound first when L3 were used. The statisti- cal analysis did not demonstrate an accelerator effect of maggot therapy in the implemented model (c2=0.12; p=0.943; gf=2). In several experiments, myiasic abscesses were observed. The type of ulcer generated, which is acute, could be a limitation for evaluating larval thera- py. The finding of myiasic abscesses must be investigated prior to recommending L. eximia as a secure agent in maggot therapy. Key words: Biological therapy, debridement, Diptera, larvae, skin care, ulcer, wound healing. 58 Rev. Chilena de Ent. 39, 2014 INTRODUCCIÓN de amonio, los cuales inhiben el crecimiento bacteriano (Sherman et al., 2000). Adicional- La terapia larval consiste en la aplicación mente se ha podido identificar la presencia de tópica de larvas de moscas (Diptera: Musco- péptidos antimicrobianos cuyas masas mola- morpha) con características necrobiontófagas res oscilan entre los 0,5 y 10 kDa y <500 Da a procesos ulcerativos dérmicos de carácter los cuales han mostrado un efecto bactericida crónico o que muestran abundante tejido ne- y bacteriostático en cepas de Staphylococcus crótico (Sherman, 1998). Ésta surge como una aureus resistentes a la meticilina (MRSA), estrategia terapéutica alternativa con respecto Bacillus cereus y Escherichia coli (Bexfield et a terapias tradicionales que incluyen procesos al., 2008). En relación con el efecto prolife- de desbridamiento, uso de agentes tópicos, rativo en el tejido dérmico se ha mencionado desinfectantes y apósitos especializados; tam- que las larvas generan sustancias de excreción bién es una alternativa ante terapias novedo- y secreción con actividad promotora del cre- sas como reemplazamientos de piel a través cimiento celular, hecho que se visualiza en la de sustitutos biológicos, aplicación de facto- aparición de importante tejido de granulación res de crecimiento, láser, oxígeno hiperbárico, como resultado de la terapia larval (Sherman estimulación eléctrica o sistemas de presión et al., 2000). En este sentido Honda et al. negativa (Moreno-Giménez et al., 2005). A (2011), pudieron determinar que los productos diferencia de las anteriores, los costos por tra- de excreción y secreción derivados de Lucilia tamiento en la terapia larval son mínimos lo sericata promueven el incremento del factor que hace de ella una terapia de potencial apli- de crecimiento de hepatocitos, HGF (hepa- cación en regiones rurales o tropicales donde tocyte growth factor), un importante factor no existen otras alternativas terapéuticas para envuelto en la solución de úlceras dérmicas. el tratamiento de úlceras (Contreras-Ruiz et Dadas estas características, la efectividad de al., 2005). la terapia larval ha sido documentada en el tra- La aposición de larvas de mosca favo- tamiento de diversos tipos de úlcera como las rece la desbridación de las úlceras, debido a de los pies, las de presión, heridas quirúrgicas varias razones; dentro de éstas figuran la ac- y traumáticas, úlceras por quemaduras y arte- ción mecánica de las piezas bucales cuando riovenosas (Sherman et al., 2000; Muncuoglu las larvas se alimentan de tejido muerto, de- et al., 1999). En algunos casos la terapia larval tritos celulares y exudados serosos (Sherman se ha podido considerar como una alternativa et al., 2000), así como la secreción de enzimas exitosa para el tratamiento de úlceras en extre- tipo tripsina, quimiotripsina, metaloproteasas midades complicadas con gangrena próximas y colagenasas que propician la degradación a ser amputadas (Sherman y Pechter, 1988). de la matriz extracelular favoreciendo la oxi- Diversas especies productoras de miasis genación del área ulcerada (Figueroa et al., han sido ensayadas en este tipo de terapia bio- 2006). Por otro lado se ha podido demostrar lógica. Dentro de ellas destacan Calliphora que las larvas de mosca tienen una importante vicina, Chrysomya rufifacies, Lucilia cuprina, actividad antimicrobiana, la cual está asociada Lucilia illustris, Lucilia sericata, Phormia re- con la secreción de compuestos alcalinizantes gina, Protophormia terraenovae (Diptera: Ca- como amoniaco, alantoína, urea y bicarbonato lliphoridae), Wohlfahrtia nuba (Diptera: Sar- cophagidae) y Musca domestica (Diptera: Mus- 1Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales cidae) (Sherman et al., 2000). De éstas, las que (CIET). 2Dpto. de Parasitología, Fac. de Microbiología, se han usado de forma extensiva en países de Universidad de Costa Rica (UCR). 3Dpto. de Microbio- Europa, Norteamérica y Suramérica son L. se- logía e Inmunología, Fac. de Microbiología (UCR). Co- rrespondencia: Ólger Calderón-Arguedas. E-mail: olger. ricata y L. illustris (Sherman y Pechter, 1988). calderon@ucr.ac.cr Recientemente se ha propuesto la utilización de Calderón-Arguedas et al.: Terapia larval con Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae). 59 L. eximia (Diptera: Calliphoridae), mosca taxo- 1177 msnm). Para dicha colecta se utilizaron nómicamente conexa a las anteriores, como redes entomológicas y como cebo se emplea- una candidata para su utilización en este tipo de ron cadáveres de ratas en estado de descom- terapia (Wolff-Echeverri et al., 2010). Lucilia posición. La identificación de especie se llevó eximia es una especie común en la región Neo- a cabo de acuerdo a los criterios establecidos tropical y una de las más frecuentes en Costa por Aubertin (1933), Vargas-Fonseca (1999), Rica (Jirón, 1979). Se le ubica primordialmente Amat et al. (2008) y Barros de Carvalho y An- en áreas urbanas, donde se alimenta de carroña, tunes de Mello-Patiu (2007). Adicionalmente frutas y desechos orgánicos diversos (Wolff- se efectuó la comprobación de la identidad Echeverri et al., 2010). larval de la progenie, utilizando las caracte- De acuerdo a Sherman et al. (2000), algu- rísticas propuestas por Vargas-Fonseca (1999) nas características deben de cumplirse para y Flores y Wolff (2009). El establecimiento y poder avalar un determinado agente como mantenimiento de las colonias se llevó a cabo candidato para su uso en terapia larval. Den- mediante la metodología descrita por Figueroa tro de éstas se incluyen la incapacidad de las et al. (2007) para el cultivo de L. sericata. larvas de invadir estratos profundos u órganos internos del hospedador, la capacidad de las Obtención de larvas estériles larvas de aglomerarse en tejido cutáneo, el de- sarrollo rápido, la facilidad de mantenimiento Se colectaron las masas de huevos a par- en condiciones de laboratorio, la facilidad de tir de las colonias. Posteriormente se suspen- efectuar los procesos de esterilización de los dieron en solución salina al 0,85% por cinco huevos y la exclusividad de las larvas por ali- minutos y luego se colocaron en hipoclorito mentarse de tejido necrótico. de sodio al 0,1% como primer tratamiento mi- Desde un punto de vista bioético se debe crobicida y para completar la disgregación de contemplar, en la fase previa a un ensayo clíni- dichas masas ovíferas. La esterilización de los co en humanos, la implementación de ensayos huevos se llevó a cabo en formalina al 5,0% preclínicos en animales, lo que garantiza la por cinco minutos. Una vez esterilizados, di- protección y seguridad de los sujetos en la eje- chos huevos fueron lavados, en condiciones de cución de los ensayos clínicos (Giridharan et asepsia, tres veces con solución salina estéril al al., 2013). Dada la necesidad de comprobar la 0,85% en una cámara de flujo laminar. Poste- idoneidad de las especies y variedades locales riormente se colocaron en placas de agar san- de moscas en la terapia larval, el presente estu- gre donde tuvo lugar la eclosión de las larvas. dio tuvo como propósito evaluar la efectividad Las placas fueron colocadas en una cámara de y seguridad del tratamiento con larvas de L. mantenimiento de insectos a una temperatura eximia de Costa Rica en la solución de úlce- de 26°C, humedad relativa al 95% y un foto- ras inducidas mediante veneno de serpiente en periodo de 12 horas. Muestras de los huevos un modelo animal, como un paso previo a su estériles fueron colocadas en caldo tripticasa- eventual utilización en seres humanos. soya y en caldo tioglicolato para verificar su condición de esterilidad 24 horas después de MATERIALES Y MÉTODOS su procesamiento. Las larvas de segundo (L2) y tercer estadio temprano (L3) fueron colecta- Establecimiento de colonias das 24 y 48 horas después de la colocación de Para el establecimiento de las colonias de los huevos en el agar bacteriológico. L. eximia, se realizó la colecta de las moscas Modelo In vivo en un área boscosa del campus universitario “Rodrigo Facio” de la Universidad de Costa En ausencia de un sistema animal con- Rica (09°56,272’N - 084°02,990’O, altitud sensuado para el estudio la terapia larval, se 60 Rev. Chilena de Ent. 39, 2014 implementó un modelo de dermonecrosis en del área ulcerada (Fig. 2a). A la rata control se ratas en el cual se utilizó veneno completo de le provocó una úlcera de acuerdo a la meto- Bothrops asper como inductor (Jiménez et al., dología descrita, se le colocó el parche Dou- 2008). Dicho veneno fue suministrado por el DERM CGF®, pero no se le trató con larvas. Instituto Clodomiro Picado de la Universidad Se registró, para cada experimento, cuál rata de Costa Rica. Los animales empleados fueron (rata de prueba o rata control) fue la que so- ratas macho de la especie Rattus norvegicus lucionó primero el proceso ulceroso o si hubo cepa Wistar, con un peso entre 150 a 200 gr. en una solución simultánea de dicho proceso. el momento de la ejecución de los experimen- Con el fin de valorar la relación entre la aplica- tos. La valoración bioética de los protocolos ción de L2 y L3 con las ratas prueba o control fue aprobada por el Comité institucional para que solucionaron primero la úlcera, se realizó el cuidado y uso de los animales (CICUA) de una prueba de Chi cuadrado de independencia la Universidad de Costa Rica. (Daniel, 1988), utilizando un coeficiente de Cada experimento implicó el manejo de confiabilidad del 95% (a:0,05). Dicha prueba una pareja de ratas, de las cuales una rata fue realizada empleando el software Statistica fue tratada con L2 o L3 de L. eximia (rata de versión 8.0 (Analytical Software). prueba) y la otra no recibió ningún tipo de tratamiento (rata control). Cada rata fue anes- RESULTADOS tesiada con Zoletil® 50 administrado por vía intramuscular en una dosis de 5,0 mg/0,1 ml El modelo implementado permitió la gene- por rata. Posteriormente se les inoculó por vía ración de úlceras de aproximadamente 1 cm subcutánea 4,7 mg/0,2 ml de veneno completo de diámetro que mostraron una erosión mani- de Bothrops asper en la región dorso torácica fiesta epidermis. La dermis presentó una colo- la cual fue previamente rasurada. Se escogió ración marrón, resultado de los procesos der- esta región, para poder garantizar que el apó- monecróticos y hemorrágicos inducidos por el sito por colocar no fuera removido por los ani- veneno (Fig. 2b). El promedio de duración de males de experimentación. A las 48 horas se los experimentos efectuados fue de 9±3 días, hizo remoción de la costra dérmica generada período en el cual por lo menos una de las ra- y la úlcera provocada fue tratada, en la rata tas experimentó la solución de la úlcera bajo de prueba, con las larvas de L. eximia en una los criterios establecidos. dosis de 5-10 larvas/cm2. Se realizaron 17 ensayos, de los cuales La aplicación de las larvas se efectuó uti- 10 emplearon L2 y 7 utilizaron L3 para las lizando la metodología descrita por Acton ratas de prueba. En 8 de los 17 experimentos (2007) con modificaciones. Brevemente, las (47,0%), las ratas tratadas exhibieron una so- larvas se confinaron al área ulcerada mediante lución más rápida del proceso ulceroso con el uso de parches DouDERM CGF® cortados respecto al control (Fig. 2a, Tabla 1). En 7 de a manera de anillos que circundaron la superfi- 17 (41,2%), la solución de las úlceras se dio cie de la piel ulcerada (Fig. 1a). Estos parches de manera simultánea (Tabla 1), y en 2 de los fueron cubiertos con la ayuda de cinta Trans- ensayos (11,8%) la rata control experimentó pore® la cual se aplicó de forma concéntrica primero la solución de la úlcera con respecto a al cuerpo del animal para garantizar la suje- la rata de prueba. De acuerdo al tipo de larva ción (Fig. 1b). El recambio de las larvas tuvo utilizado, cuando se emplearon L2, el 50,0% lugar cada 3 a 5 días, como se establece en la de las ratas tratadas experimentó una solución práctica clínica (Muncuoglu et al., 1999). Di- más rápida del proceso ulceroso, mientras que cho recambio se llevó a cabo hasta que tuviese cuando se utilizaron L3, sólo un 42,0% mani- lugar la solución del proceso ulceroso deter- festó la solución de primero con respecto al minado por una reepitelización mayor al 90% control (Tabla 1). Calderón-Arguedas et al.: Terapia larval con Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae). 61 El análisis de Chi cuadrado de indepen- 2c), los cuales se presentaron con mayor fre- dencia determinó que la distribución de las cuencia cuando se utilizaron las L2 (4/10 ex- frecuencias ocurrió de forma independiente perimentos). Con las L3, sólo se dio un absce- (c2=0,12; p=0,943; gl=2), por lo que no se so en un único experimento. En estos abscesos pudo demostrar estadísticamente, mediante se apreciaron las larvas formando furúnculos el modelo utilizado, un efecto acelerador de entre la dermis y la epidermis, en una loca- la terapia larval en la resolución de las úl- lización por lo general cercana al borde de la ceras. úlcera (Fig. 2c). Cuando estas larvas fueron Uno de los hallazgos notables en el estudio removidas para hacer el recambio respectivo, fue la ocurrencia de abscesos miásicos (Fig. tuvo lugar la solución del furúnculo. Tabla 1. Número de ensayos cuyas ratas experimentales solucionaron primero el proceso ulceroso de acuerdo al tipo de larva utilizada. Condición de la rata Tipo de larva usada (tratada/control) Total L2 L3 Rata tratada 5* (50,0)** 3 (42,0) 8 (47,0) Rata control 1 (10,0) 1 (14,2) 2 (11,8) Ambas 4 (40,0) 3 (42,8) 7 (41,2) Total 10 (100,0) 7 (100,0) 17 (100,0) * Frecuencia absoluta de ensayos, ** Porcentaje de ensayos Figura 1. Sistema de aplicación de las larvas en las ratas de experimentación. a: Disposición de larvas circunscritas a un anillo concéntrico de DouDERM CGF®. b: Sujeción de parche con cinta Transpore®. 62 Rev. Chilena de Ent. 39, 2014 Figura 2. Evaluación macroscópica de las lesiones. a: proceso ulceroso solucionado donde se observa amplia reepitelización de la zona. b: úlcera sin tratamiento no solucionada en la cual se observa el material necrótico en el centro de la úlcera. c: absceso miásico que muestra una larva de Lucilia eximia emergiendo de un furúnculo. DISCUSIÓN tratamiento con larvas de L. eximia en anima- les de experimentación. El establecimiento del La utilización de un nuevo agente terapéu- procedimiento de generación de las úlceras, tico en cualquier tipo de terapia implica nece- sitio anatómico, vía y dosis de inoculación del sariamente, como paso previo a su aplicación veneno así como el procedimiento de aplica- en seres humanos, el ensayo en animales de ción de las larvas, tuvo como propósito brin- experimentación. Esta fue la razón por la cual dar parámetros para que este modelo pueda ser se implementó el modelo animal presentado reproducible de cara a cualquier ensayo ulte- como un primer paso para valorar el compor- rior. El veneno de B. asper ha sido reconocido tamiento de L. eximia de Costa Rica en el tra- como un inductor importante de mionecrosis tamiento de úlceras en un modelo “in vivo”. local, dermonecrosis, edema y hemorragia Existen diferentes modelos animales para (Rucavado et al., 2000), por lo que la aplica- evaluar los procesos de resolución de úlceras ción controlada de dicho veneno permitió la dérmicas. Dentro de éstos figuran principal- fácil generación de úlceras dérmicas. Las ca- mente la generación de lesiones inducidas racterísticas de las lesiones obtenidas fueron por quemadura en curieles, la inducción de óptimas para ensayar los sistemas de trata- heridas asépticas en cerdos mediante la ino- miento con larvas de mosca, dada su forma, culación de halotano, oxígeno y óxido nitroso tamaño y localización. y la generación de heridas asépticas en ratas La aplicación de larvas de L. eximia en mediante la utilización de biótomos cutáneos sus estadios L2 y L3 fue llevada a cabo, en para la promoción de cicatrices de segunda la mayoría de los experimentos, sin contra- intención (González-Escobar, 2002; Moreno- tiempos de carácter operativo. Prácticamen- Giménez et al., 2005). Dado que ninguno de te desde el primer recambio se pudo advertir estos modelos genera úlceras de tamaño y can- un mejoramiento en la evolución del proceso tidad de tejido necrótico adecuado, se decidió ulceroso donde se dio paulatinamente la des- emplear veneno de serpiente como inductor aparición del tejido necrótico y su sustitución del proceso ulceroso como un primer intento por tejido de granulación. A pesar de que en para evaluar las posibilidades terapéuticas del un número importante de experimentos la rata Calderón-Arguedas et al.: Terapia larval con Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae). 63 tratada, ya sea con L2 o con L3, solucionó el L. eximia. Por otro lado Azeredo-Espin y Ma- proceso ulceroso primero que la rata control, deira (1996) reportaron una miasis en el ab- el análisis global no permitió la observación domen y región urogenital de un perro en la de diferencias estadísticamente significativas cual se determinó mediante análisis de ADN en el efecto acelerador de la terapia. Estos re- (mtDNA) y enzimas de restricción la identi- sultados pueden ser inherentes al modelo de dad del agente etiológico, que correspondió a úlcera utilizado, ya que dichas úlceras fueron L. eximia. Moretti y Thyssen (2006) describie- de carácter agudo, no infectadas y una vez ron una miasis primaria en el tejido subcutá- removida la costra epidérmica superficial, la neo de un conejo (Oryctolagus cuniculus) de cantidad tejido necrótico remanente fue limi- Campinas, Sao Paulo, Brasil, cuyo agente cau- tada. Por otro lado no se puede descartar la sal también correspondió a L. eximia. Más re- ocurrencia de toxicidad residual sobre el te- cientemente Sanford et al. (2014) describieron jido dérmico derivado del veneno en el sitio el primer caso de una miasis humana donde de la lesión (Saravia-Otten et al., 2013), hecho coexistieron dos agentes etiológicos que resul- que podría enmascarar el efecto regenerador taron ser L. eximia y Chrysomya rufifacies. El de la terapia larval en las ratas tratadas. En análisis del tiempo de colonización mediante este sentido diversos investigadores han sido el método de horas grado acumuladas (ADH) enfáticos que si bien es cierto la terapia larval determinó que la primera especie en ovipositar puede ser aplicada a cualquier tipo de úlcera, fue L. eximia (Sandford et al., 2014). su eficacia real tiene lugar en las úlceras de ca- Aunque Wolff-Echeverri et al. (2010) re- rácter crónico, como las úlceras de presión, las portan la idoneidad en el tratamiento con este úlceras en diabéticos y las arteriovenosas (Té- agente en Colombia, estudios en ese mismo llez et al., 2012). Estas lesiones son inducidas país han podido determinar la presencia de por factores intrínsecos al paciente y el tipo varios haplotipos para esta misma especie de cicatrización concerniente a su resolución (Giraldo et al., 2011), hecho que refleja la va- tiende a ser una cicatrización por segunda in- riabilidad genética inherente a la especie. Los tención (Moreno-Giménez et al., 2005). Para anteriores hallazgos junto con los resultados Téllez et al. (2012), el principal aporte de la obtenidos en la presente investigación plan- aplicación de larvas a úlceras dérmicas radica tean la necesidad de realizar más experimen- en su papel desbridante, hecho que justifica su tación que aborde tópicos histopatológicos, empleo en el tratamiento de las úlceras ante- fisiológicos y bioquímicos con el fin de enten- riormente citadas. der el potencial efecto de la terapia larval con Uno de los hallazgos, no esperado en la L. eximia en las úlceras dérmicas. Además se presente investigación, fue la ocurrencia de debe investigar de forma exhaustiva las carac- abscesos miásicos con alojamiento de larvas terísticas biológicas de las cepas locales de L. bajo la epidermis. Aunque es posible que en el eximia antes de promover su utilización masi- estrato subcutáneo se hubiese dado la concen- va en biomedicina. tración de tejido necrótico inducido por el ve- neno, y que esta condición favoreciera el alo- AGRADECIMIENTOS jamiento de las larvas bajo la epidermis, no se puede descartar que la cepa de L. eximia em- Los autores desean agradecer a la Dra. Ya- pleada exhiba cierto grado de invasividad. Va- mileth Angulo, Directora del Instituto Clodo- rios hallazgos han vinculado a L. eximia con la miro Picado (ICP), Universidad de Costa Rica ocurrencia de miasis. En este sentido Madeira (UCR) por la donación del veneno de serpien- et al. (1989) informaron sobre una miasis en te, a los Drs. José María Gutiérrez (ICP) y An- el abdomen y región urogenital de un gato de drés Moreira (CIET, UCR) por sus sugeren- 15 días de nacido cuyo agente etiológico fue cias y comentarios en el desarrollo de presente 64 Rev. Chilena de Ent. 39, 2014 estudio, a Iván Coronado y Katherine Salazar Bioestadística: Base para el análisis de la Zeledón, del Departamento de Parasitología salud. 3 ed. Limusa, México DF, pp.459-502. en la Facultad de Microbiología, por su apo- fiGuEroA, l., f. uhErEK, p. yusEf, l. lópEz y J. yo a la labor operativa y a la Vicerrectoría de florEs, 2006. Experiencia de terapia larval en Investigación de la Universidad de Costa Rica pacientes con úlceras crónicas. Parasitología por su apoyo logístico y financiero a través del Latinoamericana, 61: 160-164. proyecto 803-B1-067. fiGuEroA, l., J. florEs y s. roDríGuEz, 2007. Método de cultivo para larvas de LITERATURA CITADA moscas Lucilia sericata para terapia larval. Parasitología Latinoamericana, 62: 79-82. Acton, c. 2007. A know-how guide to using flórEz, E. y m. Wolff, 2009. 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