UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO EFECTO DE DIFERENTES CONDICIONES DE PROCESO EN LA FABRICACIÓN DE GALLETAS COMERCIALES SOBRE LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS ALÉRGENOS LECHE Y HUEVO MEDIANTE PRUEBAS ELISA Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencia de Alimentos para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencia de Alimentos CINDY MARÍA HIDALGO VÍQUEZ Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2021 ii Dedicatoria En primer lugar, a Dios porque siempre me ha bendecido. A Steven, Clau, Ale y Nacho, que han sido mi motor en este tiempo y que siempre me han apoyado en TODO. Los amo. A mi red de apoyo, que sin ellos esto no hubiera sido nunca posible para una mamá de 3 hijos: A MAMI que en los momentos más difíciles me aconsejó sabiamente, Papi, Maraya, Mapa, Tita, Tito, Roger, y Blondy. Y mi sobrino Andrés. Gracias por estar siempre ahí. También le dedico este trabajo a todas las personas que viven con alergias alimentarias, espero que estos resultados aporten un granito de arena para mejorarles su calidad de vida. Agradecimientos En primer lugar, a mi comité Asesor, la profe Rebeca además de contribuir con mi formación profesional, ha sido un gran ejemplo de humildad, solidaridad, amistad y trabajo. Adrián y la Profe Jacqui siempre me apoyaron y me guiaron con sabiduría, me retaron de forma asertiva y siempre me sentí acompañada en este proceso y Jazmín que inició este proceso conmigo y por cosas de la vida no pudo continuar. A la compañía Pozuelo, por financiar este proyecto y querer mejorar sus productos. Y como me dijo alguien por ahí… “siempre hay almas caritativas que le ayudan a la gente que está haciendo tesis”, pues tuve varias almas caritativas en este proceso: Carolina Cortes, Caro por ser incondicional en este proceso. Eric Wong, que me ayudo a aterrizar y además me brindó de forma desinteresada y sincera toda su sabiduría en la parte estadística. Lourdes Chacón, que hubiera hecho sin Lourdes, que fue mi guía en la empresa. No tengo como agradecerle. Andrea Chacón, cómo aprendí de Andrea, ahora soy toda una experta en pruebas ELISA gracias a ella y a María Jesús que inició en el mundo de los ELISA. A la profe María Lourdes, que siempre estuvo pendiente como directora de posgrado de mis avances. Al Dr. Olman Riggioni que me guio y ayudó con toda su experiencia a entender la situación de las alergias alimentarias en el país. A mis amigas de la maestría Jessica, Massiel, Eve, Caro Villalobos y mis amigas de la vida doña B y la profe Anne que siempre me alentaron, especialmente en los momentos más difíciles. A los compañeros y amigos del proyecto, la comisión y la red de alergias alimentarias, de todos he aprendido mucho. A todos los profesores del posgrado, gracias a ustedes soy un antes y un después profesionalmente hablando. Considero que una graduación es un logro social, en mi caso más porque toda mi educación la recibí por medio del Sistema de Educación Pública de Costa Rica (kínder, escuela, colegio, universidad y posgrado); por tanto, también le dedico este logro a las personas que son honradas en el pago de impuestos y a los funcionarios del sistema de educación pública que hacen su mejor trabajo, GRACIAS porque gracias a esto estoy donde estoy. A todos mis maestros y profesores desde el kínder hasta la Universidad, llegar a este punto es una construcción de muchos años. iii Hoja de firmas “Esta Tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencia de Alimentos de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencia de Alimentos” ______________________________________ _____ Dra. María Lourdes Pineda Castro, M.Sc. Representante de la Decana del Sistema de Estudios de Posgrado ___________________________________________ M.Sc. Rebeca López Calvo Directora ____________________________________________ MIA. Adrián Roda Brenes Asesor ____________________________________________ M.Sc. Jacqueline Aiello Ramírez Asesor ____________________________________________ M.Sc. Manuel Montero Barrantes Representante de la Directora del Programa de Posgrado en Ciencia de Alimentos _____________________ ______________________ Cindy María Hidalgo Víquez Sustentante iv Tabla de contenido Dedicatoria .......................................................................................................................................... ii Hoja de firmas .................................................................................................................................... iii Tabla de contenido ............................................................................................................................. iv Resumen ............................................................................................................................................. vi Lista de Cuadros ................................................................................................................................ vii Lista de Figuras ................................................................................................................................. viii Lista de abreviaturas .......................................................................................................................... ix Capítulo 1. Introducción ..................................................................................................................... 1 Capítulo 2. Marco teórico................................................................................................................... 3 2.1 Alergias alimentarias ................................................................................................................ 3 2.1.1 Leche ............................................................................................................................... 10 2.1.2 Huevo .............................................................................................................................. 12 2.2 Detección y cuantificación de alérgenos ................................................................................ 14 2.2.1 Métodos emergentes ...................................................................................................... 14 2.2.2 Métodos basados en ADN ............................................................................................... 16 2.2.3 Métodos basados en reconocimiento de proteínas........................................................ 18 2.3 Kits ELISA ................................................................................................................................ 19 2.3.1 Tipos de ELISA ................................................................................................................. 21 2.3.2 Efecto del procesamiento en la detección y cuantificación de alérgenos con pruebas ELISA ......................................................................................................................................... 24 2.3.3 Efecto de la formulación en la detección y cuantificación de alérgenos con pruebas ELISA ......................................................................................................................................... 26 Capítulo 3. Hipótesis y objetivos ...................................................................................................... 28 3.1 Hipótesis ................................................................................................................................. 28 3.2 Objetivo general ..................................................................................................................... 28 3.3 Objetivos específicos .............................................................................................................. 28 Capítulo 4. Artículo 1 ........................................................................................................................ 29 Título: ............................................................................................................................................... 29 Resumen: .......................................................................................................................................... 29 Palabras clave: .................................................................................................................................. 29 1. Introducción ............................................................................................................................. 30 2. Materiales y métodos .............................................................................................................. 32 2.1 Materiales ........................................................................................................................ 32 2.2 Contaminación de las masas y elaboración de las galletas .............................................. 33 2.3 Recolección y análisis de las muestras ............................................................................. 35 2.4 Métodos ELISA ................................................................................................................. 35 2.5 Análisis estadístico ........................................................................................................... 38 3. Resultados ................................................................................................................................ 38 4. Discusión .................................................................................................................................. 41 5. Conclusiones ............................................................................................................................ 45 6. Agradecimientos ...................................................................................................................... 46 7. Referencias ............................................................................................................................... 46 Capítulo 5. Articulo 2 ........................................................................................................................ 49 Resumen:.......................................................................................................................................... 49 v Palabras clave: .................................................................................................................................. 49 1. Introducción ............................................................................................................................. 50 2. Materiales y métodos .............................................................................................................. 52 2.1 Materiales ........................................................................................................................ 52 2.2 Contaminación de las galletas .......................................................................................... 53 2.3 Recolección y análisis de las muestras ............................................................................. 54 2.4 Métodos ELISA ................................................................................................................. 55 2.5 Análisis estadístico ........................................................................................................... 59 3. Resultados ................................................................................................................................ 60 4. Discusión .................................................................................................................................. 62 5. Conclusiones ............................................................................................................................ 67 6. Agradecimientos ...................................................................................................................... 68 7. Referencias ............................................................................................................................... 69 Capítulo 6. Observaciones generales ............................................................................................... 73 6.1 Contaminación de las galletas ................................................................................................ 73 6.2 Aspectos analíticos ................................................................................................................. 74 Capítulo 7. Conclusiones y recomendaciones .................................................................................. 74 7.1 Conclusiones .......................................................................................................................... 74 7.2 Recomendaciones .................................................................................................................. 76 7.2.1 Para futuras investigaciones ............................................................................................ 76 7.2.2 Para la industria alimentaria y laboratorios .................................................................... 76 7.2.3 A nivel regulatorio ........................................................................................................... 77 Capítulo 8. Bibliografía ..................................................................................................................... 78 Capítulo 9. Anexos ............................................................................................................................ 85 vi Resumen Introducción: Las pruebas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas son los métodos más usados en Costa Rica y el mundo para la detección y cuantificación de alérgenos en alimentos. El procesamiento de los alimentos puede afectar la sensibilidad de los métodos analíticos y factores como la matriz alimentaria, la geometría o el tratamiento térmico pueden influir en la veracidad de los resultados obtenidos. Metodología: Las galletas se elaboraron con formulaciones comerciales de una industria alimentaria y se procesaron en sus instalaciones. Se utilizó la galleta tipo cracker tradicional e integral para determinar el efecto de la formulación. La geometría se evaluó con dos moldes de galleta tipo cracker (tradicional y XL). El efecto del horneado se evaluó con la galleta tipo cracker tradicional. Se utilizaron tres kits ELISA sándwich comerciales diferentes. Para cada kit se siguió el protocolo establecido. Para todos los experimentos se tomaron muestras de 4 lotes y se analizaron dos réplicas con cada kit. Resultados: Se observó un efecto matriz en el desempeño de los kits al comparar la cantidad de alérgeno detectada por cada kit en el material de referencia puro contra la masa cruda de galleta tipo cracker tradicional contaminada con ambos alérgenos (P≤0.001). Para el alérgeno leche, este efecto se encontró en los kits de R-Biopharm y 3M, en el kit de Veratox la subestimación en la cuantificación fue igual tanto en el material de referencia como en la masa. En cuanto a huevo, el efecto matriz se encontró para los kits de 3M y Veratox, el de R-Biopharm tuvo la misma tendencia en cuanto al material de referencia y la masa cruda. Para el efecto de la formulación sobre la cuantificación de leche, se encontró una diferencia significativa (P=0.0128) en la interacción del tipo de galleta y el kit. Se encontró que el kit de R-Biopharm detecta en forma diferente el alérgeno en las formulaciones evaluadas (P=0.004). Sobre el efecto de la formulación en la cuantificación de huevo se encontró una diferencia significativa (P=0.0451) entre los porcentajes de cuantificación para las dos formulaciones, en los tres kits. Hay un efecto de la geometría sobre la cuantificación de huevo (P=0.0228), independientemente del kit. No se encontró diferencia significativa en la cuantificación de leche según la geometría (P=0.4335), ni en el tipo de galleta según el kit utilizado (P=0.4302). El efecto del horneado se presenta por igual independientemente del kit utilizado (P=0.4245) para huevo. La cuantificación de huevo posterior al horneado es entre 4 y 5 de la concentración inicial. No se encontró diferencia entre los kits (P=0.1682) para leche posterior al horneado, lo que se debe a la alta variabilidad de los datos entre los kits. Conclusiones: El efecto de la formulación se puede presentar en algunos kits para la cuantificación del alérgeno leche y en todos los kits estudiados para el caso del alérgeno huevo, posiblemente por la presencia de fibra en la galleta tipo cracker integral. El efecto del procesamiento, especialmente el del tratamiento térmico, es una de las limitaciones de estos kits para lograr detectar la cantidad real de los alérgenos en los alimentos. Es muy importante evaluar el desempeño analítico de un método con la matriz que se quiere analizar para conocer si es adecuado. Se hace necesario poder contar con otras opciones de métodos como PCR y masas para realizar análisis confirmatorios o más exactos. vii Índice de Cuadros Cuadro 1. Principales características de las proteínas de las familias de origen vegetal ........... ¡Error! Marcador no definido. Cuadro 2. Principales características de las proteínas de las familias de origen animal ............ ¡Error! Marcador no definido. Cuadro 3. Caracterización de las proteínas alérgenos de la leche de vaca según la nomenclatura de alérgenos de la Organización Mundial de la Salud y la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas (IUIS) ........................................................................................................................ 11 Cuadro 4. Características, ventajas y alérgenos para cada uno de los métodos basados en PCR ... 17 Cuadro 5. Características de los kits comerciales de ELISA para análisis de leche y huevo utilizados para el experimento. ........................................................................................................................ 36 Cuadro 6. Porcentaje de recuperación e intervalo de confianza para la caracterización de cada kit con el material de referencia ........................................................................................................... 39 Cuadro 7. Porcentaje de recuperación para cada kit entre el material de referencia y la masa cruda de galleta tipo cracker tradicional contaminada ………………………………………………………………………….39 Cuadro 8. Porcentaje de cuantificación de los alérgenos leche y huevo para las formulaciones de galleta tradicional y galleta tipo cracker integral............................................................................. 40 Cuadro 9. Características de los kits analíticos utilizados para la determinación de los alérgenos leche y huevo. .................................................................................................................................. 57 Cuadro 10. Promedios e intervalos de confianza de los porcentaje de cuantificación de los alérgenos huevo y leche con respecto a la masa cruda contaminada para las galletas con geometría tradicional y con geometría XL. ...................................................................................... 60 Cuadro 11. Promedios e intervalos de confianza de la diferencia en el porcentaje de cuantificación entre los momentos del proceso (masa cruda y galleta horneada) para los alérgenos leche y huevo................................................................................................................................................ 61 Cuadro 12. Porcentaje de cuantificación de los alérgenos huevo y leche con respecto a la masa cruda contaminada para los cuatro lotes de galletas tipo cracker tradicional, Integral y molde XL por kit………………………………………………………………………………………………………………………………………….90 Cuadro 13. Diferencia en el porcentaje de cuantificación entre los momentos del proceso (masa cruda y galleta horneada) para los alérgenos leche y huevo para los cuatro lotes de galletas tipo cracker por kit……………………………………………………………………………………………………………………………91 viii Índice de Figuras Figura 1. . Pasos genéricos para efectuar análisis ELISA en alimentos. ............................................ 21 Figura 2. Esquema de ELISA directo. ................................................................................................ 22 Figura 3. Esquema de ELISA indirecto. ............................................................................................. 22 Figura 4. Esquema de ELISA “sándwich”. ......................................................................................... 23 Figura 5. Esquema de ELISA competitivo. ........................................................................................ 24 Figura 6. Contaminación de las galletas con una gota de la solución de leche y huevo. ................. 34 Figura 7. Pasos genéricos para efectuar análisis ELISA en alimentos. .............................................. 55 Figura 8. Moldeado de galletas en la línea de producción de acuerdo con su geometría ............... 63 ix Lista de Abreviaturas Abreviatura Significado ELISA Ensayo inmuno absorbente ligado a enzimas AA Aminoácidos IgE Inmunoglobulina E CBA Canasta Básica Alimentaria IUIS Organización Mundial de la Salud y la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas ALA α-lactalbumina LF Lactoferrina BSA Seroalbúmina bovina Ig Inmunoglobulinas APLV Alergia a la proteína de leche de vaca MO Gal d 1 Ovomucoide OT: Gal d 3 Ovotransferrina LY; Gal d 4 Lisozima PCR Reacción en cadena de la polimerasa PCR-PNA-HPLC PCR-péptido ácido nucleico-cromatografía líquida de alta resolución MS Espectrometría de masas SPR Biosensores de resonancia de plasmón de superficie LFD Dispositivos de flujo lateral 1 Capítulo 1. Introducción Las alergias alimentarias han sido reconocidas como un problema de salud pública cada vez más evidente en la población mundial, teniendo reportes de prevalencia en algunos países mayor al 10% en niños (Loh & Tang, 2018) y en adultos cerca del 6% (Sánchez et al., 2019). En la región latinoamericana, en general, se cuenta con pocos estudios o estudios con limitaciones importantes sobre la prevalencia de alergias alimentarias y los principales alérgenos (Sánchez & Sánchez, 2013). Costa Rica no es la excepción, ya que en el país no se cuenta con estudios de prevalencia de alergias alimentarias. Se han reconocido un grupo de ocho alérgenos a nivel internacional como los causantes de la mayoría de las reacciones alérgicas; dentro de este grupo se incluyen la leche y el huevo (Al & Of, 2018). Se cuenta con datos a nivel mundial en los que se reporta una prevalencia de alergia a leche en niños menores de 3 años de hasta un 4% y de alergia a huevo de hasta un 2% en esa misma población (Dunlop & Keet, 2018). En Costa Rica no se cuenta con estudios de prevalencia; sin embargo, el alergólogo Dr. Olman Riggioni coincide con que en Costa Rica la leche y el huevo son alérgenos de los que más frecuentemente afectan a los preescolares (Riggioni, comunicación personal, 30 de marzo 2017). La complejidad de los mecanismos por los cuales ocurren tanto alergias como intolerancias a alimentos complica bastante determinar factores causales. Por otro lado, la severidad de la sintomatología, que cada vez causa más muertes, obliga a las industrias vinculadas con los alimentos a asumir responsabilidad en informar a los consumidores con alergias o intolerancias, con la finalidad de proteger la integridad de su salud (A. J. Lee et al., 2013; Surojanametakul et al., 2012). Durante muchos años la industria de alimentos ha cubierto su responsabilidad en el tema de brindar información de alérgenos a los consumidores mediante avisos precautorios en el etiquetado; sin embargo, esto ha conducido a un uso casi indiscriminado de esos avisos, lo cual conlleva a limitar la oferta de consumo de alimentos pre empacados para consumidores alérgicos, con lo cual se compromete la seguridad alimentaria nutricional de estas personas. 2 La tendencia en cuanto a legislación en países más avanzados en el tema de gestión de alérgenos en industria alimentaria es clara en permitir los avisos precautorios solamente cuando la empresa compruebe que no tiene forma de asegurar que el producto sea libre de uno o más alérgenos, esto mediante sistemas de gestión de alérgenos en alimentos (Al & Of, 2018; FSSC Foundation, 2019; Lopez, 2017; Programa Federal de Control de Alimentos de Argentina, 2017). La necesidad de evaluar el riesgo de los alérgenos alimentarios se deriva directamente de la insuficiencia de manejar eficazmente este peligro relacionado con la inocuidad de alimentos (Crevel et al., 2014; Hattersley et al., 2014a). La industria de alimentos debe enfocarse en brindar información veraz al consumidor, por lo que se deben mantener programas de gestión de alérgenos que ayuden a etiquetar los alimentos de forma correcta; estos programas incluyen verificación analítica de presencia de proteínas alérgenos. Cuando un alérgeno es parte de la formulación y se declara como tal en el etiquetado, no representa un riesgo, el problema real son los alérgenos no declarados, que para la persona alérgica implican un riesgo inminente. La no declaración del alérgeno puede ocurrir por factores como: estar en una cantidad no detectable por los métodos analíticos, que no se declaran de forma correcta en el etiquetado o que ocurra una contaminación por contacto cruzado. Las pruebas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) son en la actualidad los métodos cuantitativos más usados en Costa Rica para la detección y cuantificación de alérgenos en alimentos. Por lo tanto, se pretende evaluar cómo los factores relacionados con el producto y el procesamiento pueden influir en la detección y cuantificación de estos alérgenos. Las galletas son productos de consumo frecuente, a las cuales se le aplican diversos tipos de procesamiento y se usan varios ingredientes en su formulación, por lo que son productos en los que la detección y la cuantificación de los alérgenos se puede ver comprometida. Este tipo de productos generalmente se procesa en plantas con varias líneas de producción donde se podría presentar contaminación por contacto cruzado entre productos de líneas con y sin alérgenos. Esta investigación se realizó en una línea de producción de una empresa fabricante de galletas a nivel 3 comercial de Costa Rica, utilizando las formulaciones y condiciones de procesamiento propias de esta industria. Capítulo 2. Marco teórico 2.1 Alergias alimentarias Tener conocimiento sobre la naturaleza de los alérgenos alimentarios es esencial para comprender cómo se evalúan y cómo pueden ser regulados. En general, los alérgenos alimentarios son proteínas y la mayoría, si no todas las proteínas alimentarias, pueden provocar alergias en cierta medida (Barlow et al., 2015). Las alergias alimentarias son un tipo de hipersensibilidad a alimentos, en la que la reacción al alimento es una respuesta inmunitaria (Ortolani & Pastorello, 2006). Las proteínas, en general, son cadenas largas de aminoácidos (AA) y no toda la proteína es alergénica, sino que son algunas partes específicas de la proteína las que son capaces de unirse a anticuerpos como la Inmunoglobulina E (IgE), llamadas epítopos (Fiocchi et al., 2016). Algunas reacciones alérgicas son no mediadas por IgE, en las que intervienen otros mecanismos inmunológicos, posiblemente celulares (Echeverría-Zudaire et al., 2019). Los epítopos se clasifican en dos tipos según su acomodo en la proteína. Los epítopos lineales o secuenciales son AA colocados en un orden determinado en una secuencia longitudinal capaz de unir inmunoglobulina E (IgE). La secuencia de AA puede resultar del plegamiento espacial de la proteína (relacionados con la estructura secundaria y terciaria de la proteína) y, cuando son capaces de unir IgE, se denominan epítopos conformacionales. Una vez que la proteína se desnaturaliza, los epítopos conformacionales generalmente se modifican o destruyen, mientras que los epítopos lineales tienden a mantenerse (European Food Safety Authority (EFSA), 2014; Fiocchi et al., 2016). La estructura y ubicación de los epítopos dentro de la proteína representa un aspecto relevante a nivel clínico. Se ha visto que en leche los epítopos de unión a IgE lineales cortos ubicados en partes hidrofóbicas de proteínas alergénicas podrían usarse como marcadores de una alergia 4 alimentaria persistente (Hernández et al., 2012). No es posible predecir el potencial alergénico de una proteína; sin embargo, algunas características permiten agrupar las proteínas en familias considerando si conservan características estructurales en relación con su actividad biológica, si son estables al procesamiento y si son resistentes a la proteólisis por enzimas digestivas (European Food Safety Authority (EFSA), 2014). EFSA ha clasificado las proteínas alérgenas de alimentos en dos grandes grupos relacionados con su origen: las proteínas de origen vegetal y las de origen animal. Cada grupo se divide en subgrupos denominados familias. Esta clasificación por familias responde a un agrupamiento relacionado con la conformación y la estructura de las proteínas, así como su estabilidad (European Food Safety Authority (EFSA), 2014). En el ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. se puede observar las principales características de las proteínas de las familias de origen vegetal y en el ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. se pueden observar las características de las proteínas de las familias de origen animal. 5 Cuadro 1. Principales características de las proteínas de las familias de origen vegetal Características Familia de proteínas Conformación, estructuras y estabilidad Alérgenos de esta familia Superfamilia de prolaminas: contiene el mayor número de alérgenos de alimentos vegetales: Albúminas de almacenamiento de semillas 2S; proteínas de almacenamiento de semillas de cereales; inhibidores de la α- amilasa / tripsina de cereales; proteínas de transferencia de lípidos no específicas (nsLTP). Alto contenido de residuos de aminoácidos que contienen azufre. Consisten en haces de cuatro hélices estabilizadas por enlaces disulfuro, que involucran ocho residuos de cisteína bien conservados. Los enlaces covalentes disulfuro intra e intermoleculares, restringen la molécula en un andamio rígido que no se rompe fácilmente y que eventualmente puede reformarse en una posición diferente después del tratamiento. Las prolaminas de almacenamiento de semilla contienen estructuras desordenadas (reomorfas) que generan epítopos expuestos incluso después de tratamientos térmicos, además contienen estructuras repetitivas que forman agregados no covalentes, que son particularmente estables al calor. Los principales alérgenos de las nueces de árbol, el sésamo y las semillas de mostaza. Presentes alérgenos de trigo, la cebada, el arroz y el maíz. Reacciones alérgicas graves a los frutos de la familia de las rosáceas. Superfamilia de cupinas: Incluye las principales proteínas de almacenamiento de globulinas, que son la causa de la mayoría de las reacciones alérgicas a las legumbres y frutos secos Las monocupinas comprenden la mayoría de las proteínas cupina, pueden ser monoméricas, diméricas u oligoméricas, y la mayoría son enzimas. Láminas de seis hebras asociadas con hélices que forman una cavidad de barril β (en latín cupa, barril) con un sitio de unión para un ligando hidrófobo. La estructura de barril se relaciona con estabilidad de la proteína. Maní, soja, lentejas, nueces, avellanas y semillas de sésamo. Profilinas: Se encuentran exclusivamente en plantas con flores Las profilinas son proteínas citosólicas de 12 a 15 kDa. Están plegadas en una estructura globular compacta de una hoja β antiparalela encerrada por hélices α en ambos lados. La alta conservación de la secuencia y la similitud de la estructura 3D explican la fuerte reactividad cruzada serológica con otros alimentos vegetales, pólenes y látex de Hevea. Maní (Ara h 5), manzana (Mal d 4), apio (Api g 4). 6 Características Familia de proteínas Conformación, estructuras y estabilidad Alérgenos de esta familia Superfamilia Bet v 1: comprende ocho familias, entre las que se encuentran las “proteínas 10 relacionadas con la patogenia” (PR 10), las principales proteínas del látex. Son polipéptidos de 154 a 160 aminoácidos con una gran similitud de secuencia. Comparten un pliegue característico formado por siete láminas β que rodean una hélice C-terminal larga y dos hélices cortas adicionales que conectan dos hélices β -hojas y formando una gran cavidad hidrofóbica en forma de Y capaz de unir esteroles. Látex, rosáceas (Manzana, cereza, albaricoque y pera) y hortalizas apiáceas (Apio, zanahoria). Reaccionan de forma cruzada con polen de abedul Nota: elaboración propia con base en información de EFSA (2014). 7 Cuadro 2. Principales características de las proteínas de las familias de origen Animal Características Familia de proteínas Conformación, estructuras y estabilidad Alérgenos de esta familia Tropomiosinas: Familia de proteínas estrechamente relacionadas presentes en el músculo y otras células con un papel regulador en la contracción muscular Contienen una repetición de siete aminoácidos (heptada), y la mayoría de las isoformas tienen una serie de 40 heptadas continuas. Estas proteínas forman una estructura dimérica de espiral helicoidal α paralela, que luego se une de la cabeza a la cola para formar un cable que se enrolla alrededor de la hélice. Tienen estructuras repetitivas que forman agregados no covalentes, que son particularmente estables al calor. Moluscos y crustáceos Mano EF: Las proteínas de la mano EF presentan un motivo hélice-bucle- hélice. Una secuencia de generalmente 12 residuos de aminoácidos. Forman un bucle flanqueado en ambos lados por un dominio α-helicoidal de 12 residuos. El bucle es capaz de coordinar iones de calcio o magnesio con diferentes geometrías. El mismo motivo está presente en una gran familia de proteínas que se unen al calcio. La pérdida de calcio por tratamiento térmico induce importantes cambios conformacionales en la proteína, con pérdida de epítopos conformacionales. Sin embargo, los epítopos de unión a IgE restantes son suficientes para desencadenar reacciones alérgicas. Pescado 8 Características Familia de proteínas Conformación, estructuras y estabilidad Alérgenos de esta familia Caseínas: Las caseínas son proteínas de mamíferos presentes en la leche que se unen a iones calcio a través de los residuos de fosfoserina o fosfotreonina de αS1-, αS2- y β- caseína Contienen grandes regiones de estructuras desordenadas. Dichas proteínas están constituidas por cadenas polipeptídicas con diferentes estructuras secundarias en equilibrio entre sí, asemejándose a proteínas desplegadas o parcialmente desplegadas, y se denominan reomorfas. Debido a su flexibilidad, son más susceptibles a la hidrólisis por proteasas, pero no sufren cambios conformacionales y sus epítopos permanecen expuestos incluso después de tratamientos térmicos. Leche Nota: elaboración propia con base en información de EFSA (2014). 9 Se ha estudiado el efecto del procesamiento de los alimentos con alérgenos sobre la estructura de las proteínas y, especialmente, sobre los epítopos, esto debido a la tolerancia que eventualmente se puede o no generar al inducirse cambios estructurales por el procesamiento (Gomaa & Boye, 2013), siendo que algunos pacientes toleran mejor el alérgeno cuando se encuentra en productos horneados o con procesos extensivos de calor (Bavaro et al., 2019). Esto se explica con las características de las proteínas explicadas anteriormente. Los alimentos reconocidos como alérgenos varían entre regiones y países. Algunos países han dado seguimiento al tema de alérgenos alimentarios por años, lo que ha permitido que tengan muy bien documentada la evolución en cuanto a cuáles alimentos considerar alérgenos. Codex Alimentarius reconoce ocho alimentos como los principales alérgenos, denominados “los grandes 8”, que incluyen cereales que contienen gluten, crustáceos, huevos, pescado, maní, soya, leche y nueces de árboles. Estos mismos son los reconocidos por Costa Rica, adicionando al grupo de los 8 el sulfito en concentraciones de 10 mg/kg o más (Ministerio de Industria y Comercio de Costa Rica, 2012). Japón es uno de los países que ha logrado dar seguimiento e identificar sus mayores alérgenos alimentarios, esto les ha permitido generar legislación robusta para el control y declaración de estos en alimentos. Se puede identificar cómo la lista de alérgenos alimentarios en este país asiático ha cambiado con los años, reconociendo que los cambios en la dieta e inclusión de “nuevos alimentos” o alimentos que no eran usuales en su dieta pueden afectar la prevalencia de alergias alimentarias en la población (Al & Of, 2018). Cada región o país debe realizar estudios que contribuyan a identificar los alérgenos alimentarios. En los países del trópico se han identificado algunos alimentos fuera de la lista de los 8 y algunos de los que están en la lista de los 8 se han descrito como de poca prevalencia en estas regiones. Por ejemplo, cuando se habla de alta prevalencia se incluyen frutas como la piña y alimentos como el tomate, maíz, pollo, cerdo, trigo y papa (Sánchez et al., 2019). En nuestro país se carece de este tipo de estudios que contribuyan a identificar los mayores alérgenos alimentarios en el país. 10 El tratamiento general para las personas que presentan alergias a alimentos es la exclusión de la dieta de los alimentos que contienen el alérgeno. En el caso de los lactantes, la madre debe excluir estos alimentos de su dieta, debido a que pueden pasar por la leche materna al niño (Rajani et al., 2020). Las dosis de consumo del alérgeno que desencadenan una reacción alérgica varían entre individuos y se establecen de diversas formas, llevando esto a una discusión amplia sobre cuándo una cantidad de alérgeno se considera una traza y cuándo se debe declarar a los consumidores, generalmente, mediante el etiquetado de alimentos (Turner et al., 2018). Poder brindar información confiable a los consumidores sobre el contenido de alérgenos en los alimentos requiere acciones estandarizadas, sistemáticas y documentadas, que permitan identificar los peligros y realizar análisis de riesgo por parte de los operadores de alimentos. Lo anterior se debe regular mediante legislación acorde a las necesidades de las personas con alergias alimentarias en cada país, pero que, además, sea congruente con las metodologías analíticas que permitan detectar y cuantificar de forma acertada el alérgeno en los alimentos (Al & Of, 2018). 2.1.1 Leche En Costa Rica la leche es uno de los alimentos más consumidos, teniendo un consumo per cápita en el 2016 de 212 litros, según la Cámara Nacional de Productores de Leche. La leche, el queso y natilla forman parte de la canasta básica alimentaria (CBA), con un consumo estimado diario por persona de 198 g, 16 g y 9 g, respectivamente, y representan la fuente de calcio más importante en la dieta costarricense (Hidalgo Víquez et al., 2020). La leche está reconocida como el principal alimento que causa reacciones alérgicas en lactantes, siendo el primer alérgeno al que se expone el infante (Lapeña López de Armentia & Hierro Delgado, 2018). Se reporta una prevalencia en niños menores de 3 años de aproximadamente un 4% (Dunlop & Keet, 2018), en tanto que en adultos se reporta una menor prevalencia de aproximadamente 0.2% (Sicherer & Sampson, 2010), considerándose la alergia a la proteína de vaca transitoria en el 80% de los casos (Lapeña López de Armentia & Hierro Delgado, 2018). 11 La leche de vaca contiene aproximadamente 3 g de proteína /100 ml y estas proteínas incluyen 25 tipos, algunas de las cuales se han reconocido con potencial alergénico, distribuidas en las fracciones de caseína (precipitan a pH 4,6 y 20 ° C) y las de suero (solubles a pH 4,6 y 20 °C), correspondientes al 80% y 20%, respectivamente (Villa et al., 2018). Las caseínas, β-Lacto globulinas (β-LG) y la α-lacto albúmina (ALA) se consideran los principales alérgenos de la leche. Otras proteínas como la lacto ferrina (LF), la seroalbúmina bovina (BSA) y las inmunoglobulinas (Ig), se han reconocido como de gran importancia para inducir alergias a la leche (Villa et al., 2018). En la Cuadro 3 se puede observar la caracterización de las proteínas alérgenos de la leche de vaca. Cuadro 3. Caracterización de las proteínas alérgenas de la leche de vaca según la nomenclatura de alérgenos de la Organización Mundial de la Salud y la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas (IUIS) Fracción de leche Nombre proteína Nomenclatura del alérgeno Concentración en leche (g L-1) Punto Isoeléctrico # aminoácidos / Molécula Caseínas (80%) αS1-caseina Bos d 9 12.0–15.0 4.9–5.0 199 αS2-caseina Bos d 10 3.0–4.0 5.2–5.4 207 β-caseína Bos d 11 9.0–11.0 5.1–5.4 209 к-caseína Bos d 12 3.0–4.0 5.4–5.6 169 Suero (20%) β-Lactalbúmina Bos d 4 1.0–1.5 4.8 123 β-Lactoglobulina Bos d 5 3.0–4.0 5.3 162 BSA Bos d 6 0.1–0.4 4.9–5.1 582 Immunoglobulinas Bos d 7 0.6–1.0 Fuente: adaptado de Nehra et al. (2020). La caseína contiene principalmente epítopos secuenciales termoestables, la hidrólisis térmica no es suficiente para evitar la unión de IgE, por lo que es posible que persistan péptidos alergénicos posterior a un tratamiento térmico (Fiocchi et al., 2016). La mayoría de los pacientes alérgicos a la proteína de leche de vaca (APLV) están sensibilizados a α-caseína (100%) y κ-caseína (91,7%) (Lapeña López de Armentia & Hierro Delgado, 2018). Las proteínas del suero de la leche presentan comúnmente epítopos conformacionales que son muy termolábiles, por lo que al aplicar calor se induce la hidrólisis térmica de las proteínas y se 12 evita la unión de IgE específica (Fiocchi et al., 2016). En el caso de las β-LG, se ha observado que tratamientos térmicos vigorosos (121º durante 20 minutos) pueden incluso aumentar algunas características alergénicas, formándose nuevas estructuras inmunológicamente reactivas. El porcentaje de alérgicos que responden a la β-LG está entre 13-76% de los APLV. A la ALA están sensibilizados entre el 0-80% de los APLV. Para BSA están sensibilizados el 0-88% de los pacientes, pero con síntomas clínicos sólo en el 20% de los casos (Lapeña López de Armentia & Hierro Delgado, 2018). La leche y las proteínas lácteas se utilizan como ingredientes de muchas preparaciones de consumo usual en el mundo y Costa Rica no es la excepción. Muchos de los productos que contienen leche son sometidos a diversos procesamientos que comúnmente incluyen procesos térmicos, fermentaciones y deshidratado. Estos procesos tienen efectos en la estructura de la proteína que pueden derivar en cambios en la detección, cuantificación y capacidad alergénica del alimento, no siempre resultando en que una menor detección y cuantificación sea sinónimo de una disminución en la capacidad alergénica (Villa et al., 2018). 2.1.2 Huevo El huevo de gallina es un alimento ampliamente consumido, fuente de proteína y vitaminas del complejo B y es de acceso generalizado en la población, con un consumo promedio diario de 23.6 g en personas de 15 a 65 años del área urbana (Guevara-Villalobos et al., 2019). También es un alimento que forma parte de la CBA en Costa Rica, en donde se establece un consumo promedio de 36 g (Hidalgo Víquez et al., 2020). La prevalencia de alergia al huevo es de entre 2.4 y 2.6% en los primeros años de vida (Echeverría- Zudaire et al., 2019), mientras que en adultos norteamericanos se ha establecido en 0.2% (Sicherer & Sampson, 2010). Se ha identificado que el huevo genera reacciones adversas a los alimentos en el 35% de los niños alérgicos y en el 12% de los adultos. Para el huevo se ha establecido una dosis umbral entre 1 y 200 mg de huevo (0,13 a 20 mg de proteína de huevo) (J. Y. Lee & Kim, 2010). 13 El huevo consta de aproximadamente 57% de clara de huevo, 33% de yema de huevo y 10% de cáscara. El contenido de proteína del huevo entero es de aproximadamente 12,1 g de proteína total y 5,9 g de proteína de clara en 100 g de huevo (Fæste et al., 2007). Tanto la clara como la yema pueden causar reacciones alérgicas, aunque la clara, por su mayor contenido proteico, es la fuente más importante de sensibilización y de alergia en la población infantil (Echeverría-Zudaire et al., 2019). La mayoría de las reacciones alérgicas producidas por huevo son de tipos IgE mediadas. En este tipo de reacción se presentan síntomas en menos de dos horas y muy frecuentemente tienen lugar en los primeros 30 minutos (Echeverría-Zudaire et al., 2019). Aproximadamente el 90% de los epítopos de las proteínas del huevo son de conformación. La mayoría de estos epítopos de conformación son consecutivos o secuencias de aminoácidos casi consecutivas. Esto puede resultar en resistencia a la degradación de proteínas y desnaturalización de los cuatro alérgenos principales del huevo, lo que podría relacionarse con su capacidad alergénica aún en alimentos con algún grado de procesamiento (Liu et al., 2013). Los alérgenos más importantes del huevo son la ovoalbúmina (OA; Gal d 2), que representa un 54% del contenido proteico total, y la ovomucoide (MO; Gal d 1), que representa un 11%. Otras fracciones proteicas y proteínas menores descritas en la clara de huevo como alérgenos son: ovotransferrina (OT: Gal d 3), que representa un 12%, y lisozima (LY; Gal d 4) un 3,5% (Echeverría- Zudaire et al., 2019; Ji-Yun & Chan Jong, 2010). La diferencia entre las dos principales proteínas alérgenos del huevo (ovoalbúmina y ovomucoide) está en su comportamiento frente a las operaciones de procesamiento de alimentos como agitación, calentamiento o hidrólisis enzimática, donde los epítopos de unión a IgE de la proteína MO; Gal d 1, que es termoestable, son relativamente estables (Fæste et al., 2007), por lo que se conserva el potencial alergénico. Esta estabilidad ante el procesamiento implica que pacientes con sensibilización elevada a esta proteína (MO; Gal d 1) presenten reacciones con cualquier tipo de alimento que contenga huevo, independientemente de su cocinado o procesamiento (Echeverría- Zudaire et al., 2019). 14 El alérgeno más importante de la yema de huevo es la α-livetina (Gal d 5), que es la seroalbúmina de pollo. Este alérgeno se relaciona con reactividad cruzada más frecuentemente en adultos, presentando síntomas de alergia alimentaria al huevo tras consumo de yema o carne de pollo. También se reconoce su relevancia en el síndrome ave-huevo, en el cual, por inhalar partículas de plumas, el paciente se sensibiliza y desarrolla manifestaciones clínicas respiratorias. También se tiene clara una reactividad cruzada entre huevos de diferentes aves (Echeverría-Zudaire et al., 2019). 2.2 Detección y cuantificación de alérgenos La mayoría de los métodos para el análisis de alérgenos en alimentos se pueden dividir en dos grandes grupos; por un lado, están los basados en el reconocimiento de proteínas y por el otro los basados en ADN (Nehra et al., 2020). Los métodos basados en el reconocimiento de las proteínas incluyen inmunocromatografía, espectrometría de masas (MS) y ELISA (Castillo & Cassola, 2017). Los métodos de reconocimiento de ADN se basan en el reconocimiento de una secuencia especifica de ADN que indica la presencia del alérgeno como, por ejemplo, los que se basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) (Nehra et al., 2020). Estos métodos de detección de alérgenos también se pueden clasificar como cuantitativos (determinan una cantidad de alérgeno) o cualitativos (indican presencia o ausencia de las proteínas) y se encuentran disponibles para los principales alérgenos en diversas matrices alimenticias y superficies en contacto con alimentos (Schubert-Ullrich et al., 2009). Otros métodos, como la MS y los biosensores de resonancia de plasmón de superficie (SPR), se han aplicado solo recientemente para la detección y cuantificación de residuos alergénicos en algunas matrices y requieren más investigación para considerarse métodos oficiales (Zeleňáková et al., 2019). 2.2.1 Métodos emergentes Debido a que se tiene bien establecido que los procesamientos de alimentos generan cambios en la estructura de la proteína o del ADN utilizado para detectar y cuantificar alérgenos y esto afecta 15 la detección final, la MS surgió como una herramienta de confirmación final para la identificación inequívoca de alérgenos alimentarios en diferentes productos (Alves et al., 2016). Heick et al (2011) investigaron un método para la detección simultánea de siete alimentos alergénicos y se ha aplicado a muestras procesadas y sin procesar (harina y pan) por medio de MS. Se evaluó la influencia del proceso de horneado y se compararon los resultados con los obtenidos con los kits de prueba ELISA disponibles comercialmente. Se concluyó que se presentaban grandes diferencias entre los dos métodos al analizar la leche, el huevo y la soya. Para el huevo, solo un kit fue capaz de detectar el alérgeno en el producto procesado. Para la leche y la soya, las sensibilidades disminuyeron al analizar el pan o no se pudo detectar el alérgeno en absoluto. Para estos alérgenos, el método MS mostró una capacidad de detección superior para las muestras procesadas (Heick et al., 2011). Como ventaja de la MS se señala su capacidad de multiplexación (detectar varios alérgenos a la vez) y mejor sensibilidad para los alérgenos mencionados anteriormente. Una desventaja identificada en este estudio fue que hasta ese momento el método de MS desarrollado era solo cualitativo. Se propuso en el estudio como solución a esta limitación usar péptidos marcados con isótopos (Heick et al., 2011). Se han identificado otras desventajas como, por ejemplo, pocos estudios interlaboratorios, falta de repositorios de secuencias de proteínas para alimentos alergénicos, especialmente de origen vegetal, y las limitaciones conocidas que afectan todos los métodos de detección de alérgenos relacionadas con la extracción del alérgeno de la matriz (Clare Mills et al., 2019). Los biosensores (inmunosensores y aptasensores) también se han estudiado como una opción más confiable frente a las limitaciones de otros métodos, como, por ejemplo, que ofrecen una opción de detección más barata, fácil, rápida y multiplex de alérgenos de la leche en comparación con las técnicas convencionales. Un biosensor es un dispositivo integrado autónomo constituido por un componente de reconocimiento biológico (receptor bioquímico) y un elemento de transducción de señales conectado a un sistema de adquisición y procesamiento de datos. El transductor se utiliza para convertir la señal (bio) química resultante de la interacción del analito con el biorreceptor en una electrónica. La intensidad de la señal es proporcional a la 16 concentración de analito (Alves et al., 2016). El rendimiento de los biosensores depende del biorreceptor empleado, la estrategia de inmovilización (covalente, no covalente), el mecanismo de detección (es decir, electroquímico, óptico, etc.) y la reactividad cruzada de las biomoléculas (es decir, inmunorreactantes y aptámeros) a proteínas homólogas. Aunque la reactividad altamente específica de los aptámeros puede resolver el problema de la reactividad cruzada de los detectores, es necesario examinar el efecto de la variabilidad de la presentación de alérgenos de diferentes especies. La investigación con estos métodos plantea desafíos que se deben resolver, como los relativos a la inestabilidad y alto costo de los anticuerpos. Se hace evidente la necesidad de investigar más sobre este tema, por presumirse como técnicas prometedoras, pero con muy escasos estudios (Nehra et al., 2020). 2.2.2 Métodos basados en ADN La detección de alérgenos con base en el ADN implica la extracción de un fragmento de ADN que codifica un alérgeno o proteína específico, seguido de amplificación por PCR. Dentro de estos métodos recientes de detección de alérgenos en productos alimenticios basados en PCR se pueden enlistar: PCR-ELISA, PCR en tiempo real, PCR-péptido ácido nucleico-cromatografía líquida de alta resolución (PCR-PNA-HPLC), PCR dúplex y PCR- multiplex tiempo real (Alves et al., 2016). Las técnicas de PCR son fiables, muy específicas y sensibles, con límites de detección notados inferiores a 10 mg / kg de almendras, avellanas, soya, leche o maní. Permiten minimizar la reactividad cruzada y evitar resultados falsos positivos eligiendo cebadores adecuados que diferencian entre dos secuencias de ADN estrechamente relacionadas. La ventaja de las técnicas de PCR sobre los métodos basados en la detección de proteínas es la extracción eficiente de ADN en condiciones de desnaturalización, más eficaz que durante la extracción de proteínas de matrices alimentarias (Słowianek & Majak, 2011). La principal desventaja es la degradación del ADN durante el procesamiento de alimentos y la dependencia del límite de detección de la cantidad y pureza de la matriz. Las técnicas basadas en la PCR no detectan los componentes responsables de la reacción alérgica, solo el ADN específico 17 de la especie, lo cual no significa necesariamente la presencia del alérgeno (Alves et al., 2016). Estos métodos no se recomiendan para la detección de alérgenos en productos alimenticios con alto contenido de proteínas y bajo contenido de ADN, como huevos (Słowianek & Majak, 2011). Los métodos PCR constituyen una herramienta complementaria importante de los métodos inmunológicos (Alves et al., 2016). En la Cuadro 4 se muestran las características, ventajas y alérgenos para cada uno de los métodos basados en PCR. Cuadro 4. Características, ventajas y alérgenos para cada uno de los métodos basados en PCR Método PCR Características Ventajas Alérgenos identificados PCR-ELISA No requiere gel de electroforesis El fragmento de ADN amplificado se marca con biotina o digoxigenina para poder ser determinado con ELISA Alta especificidad Simplicidad del método Bajo costo de ELISA Avellana PCR- Tiempo real Aislamiento de ADN mediante extracción caotrópica de fase sólida y PCR secundaria con sonda fluorescente Taq-Man y cebadores específicos. Límites de detección muy buenos para los alimentos en que se aplica. Maní, apio, mostaza, sésamo, altramuz, anacardo, nuez, pistachos, nueces pecanas, almendras y nueces de macadamia PCR-PNA- HPLC La técnica es una modificación de la PCR utilizando sondas marcadas con ácido péptido nucleico (PNA) y detección con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Permite la detección eficaz de alérgenos potencialmente ocultos incluso en productos con presencia no declarada de avellana o como posible contaminación Avellana PCR dúplex Permite amplificar varios fragmentos de ADN simultáneamente mediante la aplicación de varios pares de cebadores Detección simultánea de dos alérgenos Avellana y maní (juntos) Dos tipos de trigo (juntos) 18 Método PCR Características Ventajas Alérgenos identificados PCR- multiplex tiempo real Permite amplificar varios fragmentos de ADN simultáneamente mediante la aplicación de varios pares de cebadores La prueba exhibe una alta especificidad y sensibilidad en el rango de 0.01%, menor para el huevo y la leche debido al bajo contenido de ADN avellana, maní, apio, soya, huevo, leche, almendra y sésamo (todos analizados al mismo tiempo) Fuente: elaboración propia con base en información de Słowianek & Majak (2011). 2.2.3 Métodos basados en reconocimiento de proteínas Dentro del grupo de reconocimiento basado en proteínas se incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), pruebas con tira reactiva, dispositivos de flujo lateral (LFD, por sus siglas en inglés) y pruebas enzimáticas (Nehra et al., 2020). De este grupo solamente las pruebas ELISA dan resultados cuantitativos, las pruebas de LFD y las tiras reactivas son metodologías cualitativas de detección. Las LFD contienen zonas donde los anticuerpos se fijan a la matriz sólida. Las muestras de hisopos de las superficies del equipo se pegan en la tira y producen líneas visibles donde ocurren las interacciones antígeno-anticuerpo. Estas pruebas son económicas, rápidas y portátiles, no requieren instrumentación y son extremadamente simples de realizar. Son específicas y sensibles y generalmente tienen límites de detección en el rango de 5 ppm (Taylor & Baumert, 2015). Las LFD se usan con frecuencia en la industria alimentaria para evaluar la limpieza de los equipos de procesamiento compartidos después del saneamiento. Los inmunoensayos de flujo lateral también se pueden multiplexar mediante la adición de múltiples líneas de prueba. Cada línea de prueba corresponde a los analitos específicos que se van a detectar, con lo que se reduce el tiempo de análisis y el desperdicio de reactivos, ya que se pueden evaluar múltiples analitos en las mismas condiciones (Ross et al., 2018). Para el análisis de sulfitos en alimentos existen otros métodos que se basan en la titulación, como el método Monier-Williams y el procedimiento Ripper (titulación yodométrica). El método Monier- 19 Williams es robusto, con un LOD ≥ 10 mg / kg, pero requiere mucho tiempo y está sujeto a pérdidas de SO2 y / o co-destilación de otros compuestos volátiles oxidables presentes en los alimentos. El método de titulación yodométrica presenta un LOD de 5 mg / kg. Sin embargo, se considera que este método carece de exactitud y precisión debido al hecho de que el yodo puede reaccionar con otros compuestos oxidables presentes en los alimentos y no puede usarse para matrices coloreadas (European Food Safety Authority (EFSA), 2014). Las pruebas ELISA son las más utilizadas para la detección y cuantificación de alérgenos en alimentos (Taylor & Baumert, 2015), y se basan en la unión específica entre epítopos en la molécula del alérgeno o una proteína específica presente en el alimento alergénico y una inmunoglobulina específicamente producida contra el elemento de interés (Alves et al., 2016). En el siguiente apartado se describen de forma amplia este tipo de pruebas, ya que son las usadas para esta investigación. 2.3 Kits ELISA En la actualidad, la verificación analítica de los requisitos de etiquetado y la detección y cuantificación de proteínas alergénicas en los alimentos es realizada principalmente por pruebas ELISA, debido a su facilidad de uso, respuesta rápida y alta sensibilidad, así como su relativo bajo costo comparado con otros métodos analíticos. Los kits de ELISA emplean principalmente anticuerpos policlonales para la detección de alérgenos alimentarios, ya que estos ofrecen el beneficio de reconocer varios epítopos diferentes en la proteína diana y son menos sensibles a pequeños cambios (Monaci et al., 2011). Sin embargo, se discute la eficiencia de los anticuerpos policlonales versus los monoclonales (Castillo & Cassola, 2017). De acuerdo con lo descrito por varios autores, el procesamiento juega un papel muy importante en la precisión (variabilidad) y exactitud (recuperación) de los kits ELISA (Gomaa & Boye, 2013; Khuda et al., 2012; Monaci et al., 2011). Se ha observado que los procedimientos de extracción y cuantificación, así como el equipo usado para el análisis de datos, pueden hacer que un kit sea más preciso para la detección de un alérgeno en lugar de otro en una sola matriz. Lo anterior debido a factores como calibradores estándares de los kits, los anticuerpos y los agentes de 20 extracción (Khuda et al., 2012). El procesamiento puede generar que las proteínas pierdan solubilidad y la capacidad de extracción en una matriz, esto debido a la sinergia que se genera entre los componentes de la matriz y la proteína alérgeno, así como los cambios químicos y estructurales que sufre la misma (Monaci et al., 2011). Todo lo anterior puede representar un riesgo en cuanto a que los datos arrojados por los kits ELISA sean confiables. La capacidad de un método ELISA para detectar proteínas de alérgenos alimentarios en una muestra de prueba se ve afectada por la eficiencia con la que estas proteínas se extraen de la muestra, así como la eficiencia con la que el anticuerpo o los anticuerpos utilizados en la prueba ELISA detectan estas proteínas. El rendimiento general de un método basado en ELISA para la detección de alérgenos alimentarios es una función de estos dos parámetros (Hengel, 2012). Los pasos genéricos para efectuar análisis ELISA en alimentos de observan en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. Cada kit tiene sus particularidades, empezando por el costo y la cantidad de muestras que se pueden analizar con cada uno. Otras variaciones son en cuanto a la cantidad de muestra para el análisis, si el buffer de extracción requiere algún aditivo adicional, el tiempo y condiciones de incubación en el baño de agua (temperatura y agitación) para realizar la extracción y el tiempo de centrifugación (en algunos kits este paso se omite). En cuanto a la parte del montaje de la placa de micro titulación, igualmente se presentan particularidades según los kits en cuanto a si se contempla alguna dilución propia del kit, a tiempos de incubación y sus condiciones, por ejemplo, agitación o no. La cantidad de lavados por muestra también varía entre kits. Para la adición del cromóforo en algunos kits se especifica que sea en condiciones de oscuridad y su posterior incubación, también; otros kits no especifican este aspecto. Por último, la longitud de onda a la que se debe hacer la lectura es otro aspecto variable. Todas estas variaciones entre kits se deben considerar a la hora de decidir con cuál trabajar, esto porque tanto el tiempo como la cantidad de reactivos tiene un impacto en el costo que implica la realización de estos análisis. 21 Nota: elaborado por la autora basado en los pasos descritos en los kits para análisis de leche y huevo de R- Biopharm, Veratox y 3M. Figura 1. Pasos genéricos para efectuar análisis ELISA en alimentos. 2.3.1 Tipos de ELISA Los ensayos de ELISA pueden ser de varios tipos: ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA tipo sándwich y ELISA competitivo. Las diferencias entre estos kits pueden generar diferencias significativas en términos de anticuerpos aplicados, proteínas diana, calibradores y procedimientos de extracción, por lo que proporcionan resultados considerablemente diferentes para el mismo analito (Török et al., 2015). En el ensayo ELISA directo, el analito (antígeno) se une directamente a la fase sólida. Los sueros que contienen el anticuerpo marcado con enzima específico junto con el extracto de muestra adecuadamente diluido se pre incuban antes de agregarlos a los pocillos recubiertos con antígeno. Es un método más rápido pero su sensibilidad no es muy buena (Schubert-Ullrich et al., 2009). En la Nota: adaptado de San Millan (2016b). 22 Figura 2 se observa el esquema de este ensayo. Nota: adaptado de San Millan (2016b). Figura 2. Esquema de ELISA directo. En el ELISA indirecto un analito se une a la fase sólida, se adiciona un anticuerpo específico del analito, y se hace una incubación adicional con un segundo anticuerpo específico de la especie marcado. Este tipo de ELISA da mejor señal y la diferencia con ELISA sándwich es que en este primero se agrega el antígeno a la placa (Kirsch et al., 2009). En la Nota: adaptado de San Millan (2016c). Figura 3 se observa el esquema del ELISA indirecto. 23 Nota: adaptado de San Millan (2016c). Figura 3. Esquema de ELISA indirecto. El ELISA tipo sándwich (s-ELISA) contiene un anticuerpo de captura específico para la proteína de interés que se inmoviliza en una fase sólida (placa de micro titulación o tiras de pocillos múltiples). Los analitos de la muestra son capturados por el anticuerpo inmovilizado y detectados por un segundo anticuerpo específico, que está marcado con enzima y se une a la proteína de interés formando un "sándwich". La absorción del producto coloreado formado después de agregar el sustrato es directamente proporcional a la concentración de analito (Schubert-Ullrich et al., 2009). El ensayo sándwich es el formato más común para la detección de alérgenos en los alimentos (Taylor & Baumert, 2015). En la Adaptado de San Millan (2016a). Figura 4 se observa la unión del anticuerpo con el analito y el efecto “sándwich” del segundo anticuerpo marcado con la enzima que reacciona con el sustrato para dar el color (pocillo izquierdo). A la derecha un pocillo negativo donde no se dio la unión del analito. 24 Adaptado de San Millan (2016a). Figura 4. Esquema de ELISA “sándwich”. El ELISA competitivo se utiliza cuando hay cantidades pequeñas del analito. El ensayo consiste en fijar un anticuerpo a la fase sólida de la placa. Posteriormente se realiza una mezcla con el analito y un reactivo con el cual compite por unión en la placa (mezcla competitiva). A la mezcla competitiva se adiciona un conjugado con la proteína de interés y una enzima para generar color. Toda esta mezcla se adiciona en la placa donde se encuentra un anticuerpo fijado a la fase sólida, donde las proteínas marcadas con el conjugado van a generar una señal de color y las proteínas de interés no generan señal. En este ensayo la señal de luz es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra (Schubert-Ullrich et al., 2009). En la Adaptado de PROTOCOLPLACE (2013). Figura 5 se puede observar un esquema del funcionamiento de los kits ELISA competitivo. 25 Adaptado de PROTOCOLPLACE (2013). Figura 5. Esquema de ELISA competitivo. 2.3.2 Efecto del procesamiento en la detección y cuantificación de alérgenos con pruebas ELISA Las modificaciones que se pueden presentar en las proteínas durante el procesamiento dependen de las condiciones del proceso, la naturaleza de la proteína y la composición de la matriz. Los procesamientos que se aplican a los alimentos a nivel casero e industrial, impactan tanto la estructura como las propiedades químicas de las proteínas. Dentro de los cambios más importantes se contemplan el despliegue y agregación de proteínas, proteólisis, glicosilación y glicación, efectos de solubilidad y pH, y redes para la formación de gel, lo que puede alterar su potencial alergénico (European Food Safety Authority (EFSA), 2014). Los procesos de producción de alimentos como tratamientos térmicos y la extrusión pueden tener una influencia significativa en la solubilidad y la capacidad de extracción de las proteínas alérgenos, así como en la capacidad del anticuerpo o anticuerpos utilizados en el ELISA para reconocerlos. Los factores que pueden influir en los resultados de la prueba incluyen: (1) interacciones con compuestos en una matriz alimentaria (por ejemplo, presencia de polifenoles y taninos); (2) solubilidad y reactividad reducidas de proteínas desnaturalizadas por calor; y (3) 26 diferencias en el perfil proteico de un alérgeno alimentario particular de diferentes especies, variedades y orígenes geográficos (Hengel, 2012). Gomaa & Boye (2013) y Monaci et al (2011) han confirmado que los procesos térmicos interfieren con la detección de las proteínas alérgenas y, por ende, se ha demostrado que el rendimiento de las pruebas ELISA se ve comprometido cuando se aplican técnicas de procesamiento de alimentos extensivas como el horneo; sin embargo, se conoce que, a pesar del procesamiento extensivo, el alimento sigue teniendo potencial alergénico (Török et al., 2015). Algunas de las consecuencias del procesamiento térmico sobre las proteínas alimentarias son: pérdida de epítopos Ig-E conformacionales, reacciones de Maillard y disminución de la solubilidad de las proteínas, capacidad de extracción o estabilidad. En particular, el calentamiento y el procesamiento tecnológico de los alimentos podrían conducir a cambios en la estructura de la proteína diana que afecta a algunos determinantes antigénicos y sitios de unión de epítopos, lo que podría comprometer la eficiente recuperación y detección de los alérgenos en los análisis ELISA (Monaci et al., 2011). Adicionalmente, se han demostrado diferencias significativas en cuanto a cuantificación y detección de los diferentes kits ELISA disponibles en el mercado (Ferrer, 2017). Un aspecto del procesamiento, poco estudiado, es la geometría comercial de los productos en cuanto a la detección de los alérgenos. Gomaa & Boye (2013) estudiaron el efecto del tamaño de la galleta en la detección de caseína, huevo, gluten y soya. Encontraron que, de forma general, la recuperación de los alérgenos decrece al disminuir el tamaño de la galleta, lo que atribuyen a que la temperatura en el centro de la galleta aumenta al disminuir el tamaño. No se encontraron estudios similares donde se haya evaluado el tamaño de la galleta. 2.3.3 Efecto de la formulación en la detección y cuantificación de alérgenos con pruebas ELISA Los alimentos son matrices complejas en las que se generan interacciones entre sus componentes, lo cual repercute en la capacidad de las proteínas alérgenas para acoplarse con los 27 anticuerpos, generando una disminución o aumento de la capacidad de las proteínas a unirse a estos (Lacorn et al., 2018). El efecto del procesamiento sobre el desempeño de los kits ELISA ha sido ampliamente estudiado. Por el contrario, del efecto de la composición de la matriz sobre este desempeño se encuentran pocos estudios, a pesar de que se reconoce la matriz como un factor importante a considerar para el uso de estos kits (Török et al., 2015). El hecho de que la proteína puede perder su potencial alergénico beneficia a algunas personas con alergias alimentarias, ya que aumenta la tolerancia a estos alimentos. Sin embargo, surge un aspecto negativo considerando que esa incapacidad de la proteína para unirse a los anticuerpos limita la detección de estas en los alimentos. Se ha visto que esta limitación en la capacidad de los Kits ELISA para detectar y cuantificar las proteínas alergénicas no necesariamente indica que la proteína no es potencialmente peligrosa para las personas con alergias alimentarias (Al & Of, 2018). También se ha descrito que la matriz alimenticia puede afectar la detección y cuantificación de los alérgenos, considerando si cuenta con uno o varios alérgenos en la matriz, lo que puede implicar variaciones en los resultados debido a la reactividad cruzada que podrían presentar los antígenos con los anticuerpos. Debido a esto es que se deben considerar factores como la formulación, qué tan homogénea es la matriz e, incluso, la cantidad y tipo de alimentos que la conforman (Török et al., 2015). Toyosaki et al. (2006) estudiaron el efecto de la sal en masas de pan crudas y el producto terminad, sobre la capacidad de unión de proteínas de huevo (ovomucoide (tipo III), ovomacroglobulina (tipo II), ovomucina (tipo I), ovoalbúmina (tipo VII), ovotransferrina (tipo I) y lisozima. Encontraron que la sal disminuyó la capacidad de unión con anticuerpos en las pruebas ELISA, tanto en la masa cruda como en el pan; por ende, se disminuye la detección. Sin embargo, este efecto también ocurre con la unión a IgE en el cuerpo humano (medida in vitro con sueros humanos), por lo que disminuye la capacidad alergénica del alimento (Toyosaki et al., 2006). El dilema está en si esa disminución en la capacidad alergénica es suficiente para una cantidad considerable de personas con alergia (European Food Safety Authority (EFSA), 2014). 28 Otro estudio comparó los resultados analíticos de cuantificación con kits ELISA comerciales para clara de huevo, caseína, soya y gluten en matrices modelo a base de harina de amaranto y basadas en harina sin gluten. Los resultados muestran que las concentraciones medidas de las muestras a base de harina de amaranto son más bajas (diferencia significativa), a excepción de las masas y galletas que contenían soya. La harina de amaranto tiene mayor contenido de proteínas y lípidos; ambos componentes están presentes en un nivel diez veces superior en comparación con la harina sin gluten. En consecuencia, es posible que los dos tipos de matrices conduzcan a diferentes propiedades físicas, solubilidad, etc. de las proteínas investigadas y / o afinidad modificada por los anticuerpos (Török et al., 2015). Para esta investigación no se estudió el efecto sobre la capacidad alergénica de las formulaciones evaluadas. 29 Capítulo 3. Hipótesis y objetivos 3.1 Hipótesis La detección y cuantificación de alérgenos de leche y huevo mediante pruebas ELISA en galletas se ve afectada por las características del kit usado, la geometría, los ingredientes de la formulación y el perfil de horneado de las galletas. 3.2 Objetivo general Evaluar el efecto de diferentes condiciones de proceso en la fabricación de galletas comerciales sobre la detección y cuantificación de los alérgenos leche y huevo mediante pruebas ELISA 3.3 Objetivos específicos 1. Comparar el desempeño analítico de tres kits tipo ELISA con los que se realizarán los ensayos de los alérgenos leche y huevo. 2. Evaluar el efecto de la formulación de galletas comerciales en la detección y cuantificación de los alérgenos leche y huevo 3. Evaluar el efecto de la geometría comercial de galletas sobre la detección y cuantificación de los alérgenos leche y huevo en el producto final. 4. Evaluar el efecto del perfil de horneo de galletas a nivel industrial sobre la detección y cuantificación de los alérgenos leche y huevo. 30 Capítulo 4. Artículo 1 Título: Efecto de la formulación comercial de galletas saladas en la cuantificación de alérgenos leche y huevo comparando tres kits ELISA Resumen: Introducción: Las pruebas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas son los métodos más usados en Costa Rica y el mundo para la cuantificación de alérgenos en alimentos. La matriz por analizar puede tener un efecto en el nivel de cuantificación con este tipo de pruebas. Metodología: Las galletas se elaboraron con formulaciones comerciales en una industria alimentaria. Se utilizó la galleta tipo cracker tradicional e integral. Se utilizaron tres kits ELISA comerciales diferentes, tipo sándwich (indicar las marcas de los kits), tanto para leche como para huevo. Para cada kit se siguió el protocolo establecido por el proveedor. Resultados: Para el efecto de la formulación sobre la cuantificación de leche, se encontró un efecto significativo (P=0.0128) en la interacción del tipo de galleta y el kit. Se encontró que el kit de R-Biopharm detecta en forma diferente el alérgeno en las formulaciones evaluadas (P=0.004). Sobre el efecto de la formulación en la cuantificación de huevo se encontró una diferencia significativa (P=0.0451) entre las dos formulaciones para los porcentajes de cuantificación, en los tres kits. Conclusiones: El efecto de la formulación se puede presentar en algunos kits para la cuantificación de alérgenos en leche. Para huevo se concluye que hay un efecto de la formulación sobre la cuantificación del kit, independientemente de la marca usada. Algún componente (probablemente la fibra) de galleta integral tiene un efecto sobre la cuantificación de los alérgenos estudiados. Palabras clave: Alérgenos alimentarios, formulación, ELISA, cuantificación, galletas 31 1. Introducción En la Región Latinoamericana, en general, se cuenta con pocos estudios o estudios con limitaciones importantes sobre la prevalencia de alergias alimentarias y los principales alérgenos (Sánchez & Sánchez, 2013) y Costa Rica no es la excepción. Se han reconocido un grupo de ocho alérgenos a nivel internacional como los causantes de la mayoría de las reacciones alérgicas; dentro de este grupo se incluyen la leche y el huevo (Al & Of, 2018). A nivel mundial, se cuenta con datos en los que se reporta una prevalencia de alergia a leche en niños menores de 3 años de hasta un 4% y de alergia a huevo de hasta un 2% en esa misma población (Dunlop & Keet, 2018). Durante muchos años la industria de alimentos ha cubierto su responsabilidad en el tema al brindar información de alérgenos a los consumidores mediante la declaración de ingredientes y avisos precautorios en el etiquetado; sin embargo, esto ha conducido a un uso casi indiscriminado de esos avisos, lo cual conlleva a limitar la oferta de consumo de alimentos pre empacados para consumidores alérgicos, con lo cual se puede ver afectada la disponibilidad a ciertos alimentos por estas personas. Cuando un alérgeno es parte de la formulación, y se declara como tal en el etiquetado, no representa normalmente un riesgo. El problema real son los alérgenos no declarados, que para la persona alérgica implica un riesgo inminente si lo consume (Taylor et al., 2014). La no declaración del alérgeno puede ocurrir por factores como: ausencia de un programa de gestión de alérgenos en la industria (Programa Federal de Control de Alimentos de Argentina, 2017) o por estar en una cantidad no detectable por los métodos analíticos. Esto último puede deberse a que la concentración del alérgeno está por debajo del límite de detección o cuantificación o porque hay una transformación en la estructura de las proteínas provocada por diferentes factores relacionados con la composición y el procesamiento, y esto afecta su capacidad de detección y cuantificación, pero no su capacidad alergénica (Hattersley et al., 2014). Las pruebas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) son en la actualidad los métodos cuantitativos más usados en Costa Rica y en el mundo para la detección 32 y cuantificación de alérgenos en alimentos (Garber et al., 2020). El efecto del procesamiento sobre el desempeño de los kits ELISA ha sido ampliamente estudiado; por el contrario, del efecto de la composición de la matriz sobre este desempeño se encuentran pocos estudios, a pesar de que se reconoce la matriz como un factor importante a considerar para su uso (Török et al., 2015). Durante las reacciones alérgicas, el antígeno (alérgeno) se acopla con el anticuerpo que genera la reacción alérgica. Bajo este mismo fundamento, los kits ELISA cuentan con anticuerpos capaces de reconocer un antígeno especifico en los alimentos y por diversos métodos generar una señal que se detecta en un equipo especifico. Los alimentos son matrices complejas, en las que se generan interacciones entre sus componentes, lo cual repercute en la capacidad de las proteínas alergénicas para acoplarse con esos anticuerpos, generando una disminución o aumento de la capacidad de las proteínas a unirse a estos (Lacorn et al., 2018). Esos cambios en la capacidad de unión con anticuerpos podrían presumir un cambio en el potencial alergénico de la proteína, aumentándolo o disminuyéndolo. El hecho de que la proteína puede disminuir su potencial alergénico, beneficia a algunas personas con alergias alimentarias, ya que aumenta la tolerancia a estos alimentos. Sin embargo, se ha visto que lo anterior puede representar una limitación en la capacidad de los Kits ELISA para detectar y cuantificar las proteínas alergénicas y no necesariamente indica que la proteína no es potencialmente peligrosa para las personas con alergias alimentarias (Al & Of, 2018). También, se ha descrito que la matriz alimenticia puede afectar la detección y cuantificación de los alérgenos, considerando si cuenta con uno o varios alérgenos en la matriz, lo que puede implicar variaciones en los resultados por la reactividad cruzada que podrían presentar los antígenos con los anticuerpos. Debido a esto es que, para la selección de un método analítico para la detección y cuantificación de alérgenos, se deben considerar factores como la formulación, qué tan homogénea es la matriz e, incluso, la cantidad y tipo de alimentos que la conforman (Török et al., 2015). Las galletas son alimentos comúnmente consumidos en Costa Rica, con una ingesta promedio diaria de 12 g en la población de 15 a 65 años del área urbana (Guevara-Villalobos et al., 2019), 33 que están compuestas por una gran variedad de ingredientes; por lo tanto, representan un desafío analítico para la detección y cuantificación de alérgenos por medio de las pruebas ELISA. El objetivo de esta investigación es evaluar el efecto de la formulación comercial de galletas saladas en la cuantificación de leche y huevo comparando el desempeño analítico de tres kits ELISA disponibles comercialmente en Costa Rica. 2. Materiales y métodos 2.1 Materiales La formulación, elaboración y procesamiento de las galletas se llevó a cabo en la compañía de galletas Pozuelo DCR.SA, que distribuye sus productos a nivel centroamericano. Esta planta se ubica en San José, Costa Rica. La empresa cuenta con un programa de Gestión de Alérgenos que va desde la recepción de la materia prima hasta el empaque, también cuenta con certificación FSSC 22000 y por estas razones fue seleccionada para trabajar esta investigación. El estudio se realizó en la línea de producción de galletas tipo cracker. Se utilizó la formulación de galleta tipo cracker tradicional y la de galleta integral, sin modificaciones. La diferencia entre estas formulaciones es que la galleta integral contiene tres ingredientes que la tradicional no tiene, estos son: salvado limpio, dextrosa monohidratada y edulcorante. Ambas formulaciones cuentan con el mismo flujo de proceso, lo cual permite evaluar el efecto de la formulación. Para la contaminación con huevo se utilizó el material de referencia NIST 8445 (valor de fracción de masa de referencia = 48% +/- 1%) y para el experimento con leche se usó el material de referencia certificado para alérgenos MoniQA MQA082016 (17 mg/kg de proteína de leche). La contaminación de las masas se dio en un ambiente controlado ya que estos son alérgenos que el producto no contiene en su formulación. Cabe indicar que el blanco (masa cruda sin contaminar) resultó negativa para trazas de estos alérgenos, es decir solamente se contabilizó la cantidad del alérgeno que se le adicionó de forma intencional. 34 2.2 Contaminación de las masas y elaboración de las galletas Debido a que las masas se contaminaron en la empresa en la que se producen y las cantidades con que trabajan son muy grandes, se decidió contaminar las masas con el alérgeno una vez que estaban moldeadas, antes de ser horneadas. Se trabajó con las masas del final del lote de producción de galleta tipo cracker tradicional y se aprovechó el cambio de masa a galleta integral; por lo tanto, para el segundo producto las galletas contaminadas fueron las del inicio de la producción. Entre los cambios de masa se realizó una limpieza de la línea de producción y se tomó masa sin contaminar (o blanco), la masa cruda contaminada y el producto final para ambas formulaciones. Ninguna de las dos formulaciones contiene huevo o leche como ingredientes de la formulación, por lo que ambas se contaminaron con proteína de huevo y proteína de leche con los materiales de referencia mencionados anteriormente. El nivel de concentración se estableció considerando la mayor cantidad de material de referencia disponible para poder asegurar una mejor distribución del alérgeno. El cálculo de proteína se hizo por el peso de cada galleta y se estableció el siguiente protocolo de contaminación. Se realizó una solución con los dos alérgenos en las concentraciones establecidas. Para el lote 1 estas concentraciones difirieron de las de los lotes 2, 3 y 4, debido a la disponibilidad del material de referencia al momento de preparar cada ensayo, siendo 200 y 100 ppm de huevo y 138 y 500 ppm de leche, respectivamente. Los resultados se reportaron como el porcentaje de alérgeno detectado en la galleta con respecto a la concentración detectada en la masa cruda para no considerar las otras fuentes de variación como el efecto matriz y que el único factor que se reporte sea la formulación. Adicionalmente, se cuantificó la cantidad del alérgeno leche y huevo con cada uno de los respectivos kits en los materiales de referencia, esto para conocer el desempeño del kit ante el material de referencia sin tener un efecto matriz. Para calcular el porcentaje de recuperación se aplicaron los factores indicados por cada kit para convertir el resultado a proteína de leche o huevo, esto porque no siempre el resultado de los kits se expresa en mg/kg (ppm) de proteína del 35 alérgeno. Esta determinación se realizó por triplicado. Por último, se comparó el porcentaje de cuantificación de los alérgenos en la masa cruda con respecto a la cantidad con la que se contaminó y el porcentaje de cuantificación obtenido con el material de referencia. Esto con el fin de identificar si se presentó algún efecto matriz. Para efectos de este estudio, se entiende como efecto matriz el efecto en la cuantificación del alérgeno en la masa cruda, comparado con el comportamiento del kit ante la cuantificación del material de referencia. El efecto de la formulación es el comportamiento de cuantificación entre las dos diferentes formulaciones de galleta eliminando el efecto matriz en las masas crudas; es por esto que el porcentaje de cuantificación para determinar el efecto de la formulación es con respecto a la cantidad detectada en la masa cruda de forma analítica y no con respecto a la cantidad contaminada. Se realizó una solución para cada masa cruda (para asegurar mejor distribución del alérgeno). Cada solución se mezcló con un Vortex por aproximadamente 10 minutos. Con una micropipeta y puntas nuevas para cada masa y galleta se procedió a contaminar adicionando 115 µl de la solución con los alérgenos en el centro de la galleta (Figura 6). Antes de la contaminación se verificó el peso promedio de las galletas para asegurar que era con el que se había realizado el cálculo de ppm. Figura 6. Contaminación de las galletas con una gota de la solución de leche y huevo. Con respecto al horneado de las galletas, las condiciones (temperatura, tiempo, flujos de aire y 36 eficiencia de la llama del horno) fueron las mismas para ambas formulaciones. Sí es importante aclarar que el horneado, aunque fue el mismo para ambas formulaciones, tiene un efecto diferente sobre los componentes de una matriz alimentaria. Este efecto se contempla dentro de lo que se está reportando como efecto de la formulación. 2.3 Recolección y análisis de las muestras Se recolectaron muestras de cuatro lotes diferentes, en distintas semanas de producción. Cada lote contaminado se recolectó y procesó completo para asegurar que todo el alérgeno adicionado fue recuperado. Las masas y galletas se empacaron en bolsas plásticas y se trasladaron al laboratorio de química del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA) ubicado en la sede Rodrigo Facio de la Universidad de Costa Rica, San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa Rica, donde fueron realizados los análisis de cuantificación mediante la técnica ELISA. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su análisis. Se analizaron las masas crudas sin contaminar (blanco), contaminadas y las galletas una vez horneadas. Las masas se liofilizaron para lograr una mejor distribución de los alérgenos, pero, como las galletas tenían una humedad relativamente baja (5.9-7.3 g/100g), no se requirió hacerles este proceso. A cada muestra se le analizó la humedad por el método de análisis 935.39A AOAC. Los resultados se presentan en porcentaje de cuantificación en base seca para cada alérgeno partiendo de la cantidad analítica determinada en las masas crudas contaminadas. 2.4 Métodos ELISA Se utilizaron tres kits analíticos tipo ELISA sándwich de diferentes casas comerciales. Para cada kit se siguió el protocolo establecido en el inserto que incluye y se solicitaron algunas aclaraciones a los proveedores cuando surgieron dudas. De cada muestra se analizaron dos réplicas. Cada kit tiene sus particularidades en cuanto a la cantidad de muestra para el análisis, si el buffer de extracción requiere algún aditivo adicional, el tiempo y condiciones de incubación en el baño de agua (temperatura y agitación) para realizar la extracción y el tiempo de centrifugación (en algunos kits este paso se omite). 37 Para el montaje de la placa de microtitulación, igualmente, se presentan particularidades según los kits, en cuanto a si se contempla alguna dilución, los tiempos de incubación y sus condiciones; por ejemplo, agitación o no. La cantidad de lavados por muestra también varía entre kits. En algunos kits se especifica que la adición del cromóforo debe ser en condiciones de oscuridad y su posterior incubación también; otros kits no especifican este aspecto. Por último, la longitud de onda a la que se debe hacer la lectura es otro parámetro variable. En el Cuadro 5 se muestran las características de los kits comerciales de ELISA para análisis de leche y huevo utilizados en el experimento. Cuadro 5. Características de los kits comerciales de ELISA para análisis de leche y huevo utilizados para el experimento. Nombre del Kit Especificidad Límite detección Límite de cuantificación Expresión de resultados ELISA RIDASCREEN® Fast Milk R- Biopharm Caseínas y la βlactoglobulina (β-LG) de la leche de vaca 0.7 mg/kg (ppm) de proteína de leche 2,5 mg/kg (ppm) de proteína de leche mg de proteína de leche/ kg de galleta (ppm) Veratox Total Milk Allergen Quantitative 8470 Veratox Caseínas y proteínas de suero 1 ppm 2.5–25 ppm ppm de leche en polvo descremada Leche bovina entera 3M Proteína total de leche bovina 5,8 ppb 1 ppm ppm de proteína total de leche bovina RIDASCREEN®FAST Ei / Egg Protein R-Biopharm Proteínas de la clara de huevo ovoalbúmina y ovomucoide Huevo entero de 0,10 mg / kg (ppm) (corresponde a 0,03 mg / kg (ppm) de proteína de clara de huevo) Huevo entero de 0,5 mg / kg (ppm) (corresponde a 0,13 mg / kg (ppm) de proteína de clara de huevo) mg / kg de huevo entero en polvo. Egg veratox Veratox Anticuerpos contra Ovomucoide (Gal d1), Ovoalbúmina (gal d2), Ovotransferrina (Gal d3}9 y Lisozima 1 ppm 2.5–25 ppm (100– 1000 ng/mL) ppm de proteína de huevo 38 Kit ELISA para Proteína de Clara de Huevo 3M Anticuerpo anti-clara de huevo 2,1 ng/mL (ppb) 0,5 ppm ppm de clara de huevo Para cada kit se utilizó el software indicado por cada casa comercial. En el caso de los kits de R- Biopharm se aplica un factor de dilución contemplado en los estándares de 100 y 50 para ELISA RIDASCREEN® Fast Milk y RIDASCREEN® FAST Ei/Egg Protein, respectivamente. Los factores de dilución adicionales se incluyeron en el software para el cálculo. Para el caso de los kits Veratox Total Milk Allergen Quantitative y Egg veratox no se indica algún factor de dilución es propio del kit y los adicionales de igual forma se incluyeron en el software para ser contemplados en el cálculo. Con respecto a los kits Leche bovina entera y Kit ELISA para Proteína de Clara de Huevo de 3M se indica que tienen un factor de dilución de 100, más cualquier otra dilución que se realice. Esos datos no se pueden incluir en el software que provee la empresa; por lo tanto, se realizaron los cálculos por aparte. Además, los resultados se deben pasar de ppb a ppm. Las fórmulas aplicadas para estos cálculos son las siguientes. [1] ppb calculado por software a partir de absorbancia *100 = ppb contemplando dilución del kit [2] ppb contemplando dilución del kit * factor de dilución adicional = ppb cuantificadas en la muestra [3] ppb obtenida / 1000 = ppm cuantificada en la muestra En cuanto a la calidad de los análisis, para cada corrida realizada con los kits R-Biopharm y Veratox – Neogen se montó como control material de referencia, esto con la finalidad de obtener el estadístico de desempeño Z. Para todas las pruebas con estas dos marcas de kits, tanto para leche como para huevo, se obtuvo un valor Z satisfactorio (menor o igual a 2 o -2) con respecto al valor obtenido en la ronda interlaboratorios FAPAS 27204, 2017, para ambos alérgenos. Para los kits de 3M no se contaba con datos de este tipo, por lo que el parámetro de calidad fue que el porcentaje de cuantificación del material de referencia se encontrara en el rango aceptable para pruebas ELISA (50-150%) (Abbott et al., 2010). 39 2.5 Análisis estadístico Se utilizó un diseño experimental estadístico de bloques completos al azar, donde el bloque estuvo representado por cada lote, que a su vez coincide con cada repetición. Para el análisis del efecto matriz, se usó un arreglo factorial 3 x 2 con los siguientes factores: los Kits analíticos (3 kits diferentes) y las matrices (material de referencia y masa cruda de galleta tipo cracker tradicional). La variable respuesta fue el porcentaje de cuantificación con respecto a la cantidad de proteína certificada en el caso del material de referencia y el porcentaje de cuantificación con respecto a la concentración con la que se contaminó la masa cruda del alérgeno. Se realizó un ANDEVA con un nivel de significancia del 5% en el que se evaluaron las significancias de los efectos simples de los factores y su interacción. Al encontrar significancia (P < 0,05) se realizó la prueba de Tukey para identificar las diferencias. Con respecto al efecto de la formulación, se usó un arreglo factorial 3 x 2 con los siguientes factores: los Kits analíticos (3 kits diferentes) y las formulaciones (2 formulaciones diferentes). La variable respuesta fue el porcentaje de cuantificación con respecto a la concentración detectada en la masa cruda del alérgeno. Se realizó una ANDEVA con un nivel de significancia del 5% en el cual se evaluaron las significancias de los efectos simples de los factores y su interacción. Para analizar la interacción se utilizó la comparación de Bonferroni para un nivel de significancia de 0.017 (usando las pruebas de contraste entre la interacción). El análisis estadístico se realizó en el software JMP® Pro 9.0.2. 3. Resultados Debido a que en todos los casos los kits detectaron los alérgenos, los resultados están planteados en función de la cuantificación. Se realizó una prueba de porcentaje de recuperación para el material de referencia, con la que se pretendía verificar la tendencia de cuantificación de cada kit ante el material de referencia solo, sin un posible efecto matriz interfiriendo. En el Cuadro 6 se muestran los resultados del porcentaje de recuperación del material de referencia para cada kit estudiado. 40 Cuadro 6. Porcentaje de recuperación e intervalo de confianza para la verificación de cada kit con el material de referencia Alérgeno R-Biopharm Veratox 3M Promedio ± IC Leche (MQA082016, 17 mg/kg) 130±1 35±0 70±1 Huevo (NIST 8445, 48% +/- 1) 110±3 180±1 200 ± 15 Las tendencias en cuantificación, incluso con el material de referencia certificado, fueron diferentes entre los kits. Cuadro 7. Porcentaje de recuperación para cada kit entre el material de referencia y la masa cruda de galleta tipo cracker tradicional contaminada Kit R-Biopharm Veratox 3M Alérgeno Matriz Promedio1 ± IC Leche Material referencia 130±10a 35±2a 70±5a Masa cruda tradicional contaminada 20±10b 30±10a 200±50b Huevo Material referencia 110±5a 200±10a 205±15a Masa cruda tradicional contaminada 120±10a 100±20b 75±10b 1/Para cada alérgeno por separado letras distintas en una misma columna denotan diferencia significativa (P < 0,05). El material de referencia tuvo tres repeticiones, la masa cruda contaminada tradicional tuvo 4 repeticiones. En el Cuadro 7 se puede observar un efecto matriz tanto para leche como para huevo dependiendo del kit (P=<0.001). Se encontró este efecto para los kits de R-Biopharm y 3M, debido a que el comportamiento de cuantificación entre el material de referencia solo y la masa cruda fue diferente. Este efecto no se encontró para el kit Veratox, debido a que la subestimación fue igual en el material de referencia y en la masa cruda. En cuanto a huevo, no se observó un efecto matriz en el kit de R-Biopharm debido a un comportamiento similar entre la cuantificación del material de referencia y la masa cruda. Para los kits de 3M y Veratox sí se encontró un efecto matriz con este alérgeno. Debido a lo encontrado en este análisis preliminar es que se decidió partir de la concentra