RESISTENCIA GENÉTICA DE HÍBRIDOS DE TOMATE [Solanum lycopersicum L. (MILL.)] AL VIRUS DEL BRONCEADO (TSWV) Julio Gabriel1/*, Daniel Sanabria**, Silene Veramendi*, Giovanna Plata*, Ada Angulo*, Mario Crespo* Palabras clave: DAS-ELISA, severidad, homocigosis, heterocigosis, susceptibilidad, alelo. Keywords: DAS-ELISA, severity, homozygous, heterozygous, susceptibility, allele. Recibido: 30/08/12 Aceptado: 11/12/12 1/ Autor para correspondencia. Correo electrónico: j.gabriel@proinpa.org * Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Agronomía Costarricense 37(1): 61-69. ISSN:0377-9424 / 2013 www.mag.go.cr/rev agr/index.html www.cia.ucr.ac.cr ** Facultad de Bioquímica y Farmacia de la Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia. ABSTRACT Genetic resistance of tomato hybrids [Solanum lycopersicum L. (Mill.)] to tomato spotted wilt virus (TSWV). This research was conducted at the PROINPA Foundation’s greenhouse and laboratory in Cochabamba, Bolivia in 2012. Its objective was to evaluate the resistance and susceptibility to Tomato spotted wilt virus – TSWV, Tomato cholorotic spot virus – TCSV and Groundnut ringspot virus – GRSV in 10 tomato hybrids. Phenotypic and molecular pattern (SCAR marker SW-421) evaluations were performed in order to differentiate homozygous and heterozygous resistant from susceptible plants. Results showed that molecular marker Sw421 is co-located with the TSWV-resistance Sw-5 gene. A TSWV-resistance band (R) was observed at 940 bp and showed the homozygous presence of the Sw-5 allele (Sw-5/Sw-5) in PROINPA 2 (Aguai) and PROINPA 9 (Bonita) varieties. PROINPA 1 (Andinita), PROINPA 3 (Arami), PROINPA 4 (Yara), PROINPA 5 (Pintona), PROINPA 6 (Jasuka) and PROINPA 10 (Bola Pera) varieties, showed a TSWV resistance band (H) at 900- 940 bp in the heterozygous state (Sw-5/Sw-5+). Only PROINPA 7 (Redonda), the male parent 71 LACHING 89S Sw-5 and the variety Shannon showed TSWV susceptibility gene (S) at 900 bp in the homozygous-recessive state (Sw-5+/Sw-5+). The results of the severity analysis and of DAS- ELISA were confirmed by the molecular analysis. RESUMEN La presente investigación se realizó en el invernadero y laboratorio de la Fundación PROINPA en Cochabamba - Bolivia en el 2012. El objetivo fue evaluar la resistencia y suscep- tibilidad de plantas a los virus Tomato spotted wilt virus – TSWV, Tomato cholorotic spot virus – TCSV y Groundnut ringspot virus – GRSV en 10 híbridos de tomate mediante evaluación feno- típica y del patrón molecular (marcador SCAR Sw- 421), que distingue los homocigotos y hete- rocigotos resistentes del susceptible. Los resul- tados mostraron que el marcador SW-421 se co- localizó con el gen Sw-5 de resistencia a TSWV. Se observó la presencia de la banda de resistencia (R) para TSWV a 940 bp en las variedades PROINPA 2 (Aguaí) y PROINPA 9 (Bonita) en estado homocigoto dominante (Sw-5/Sw-5). Las variedades PROINPA 1 (Andinita), PROINPA 3 (Arami), PROINPA 4 (Yara), PROINPA 5 (Pintona), PROINPA 6 (Jasuka), y PROINPA 10 (Bola Pera), mostraron la banda resistencia (H) a TSWV a 900-940 bp en estado heterocigoto (Sw-5/Sw-5+). Solamente la variedad PROINPA 7 (Redonda), el padre 71 89S LACHING SW-5 y la variedad Shannon mostraron el gen de suscep- tibilidad (S) al TSWV a 900 bp en estado homo- cigoto recesivo (Sw-5+/Sw-5+). Los análisis de severidad y de DAS-ELISA fueron confirmados con el análisis molecular. AGRONOMÍA COSTARRICENSE62 Agronomía Costarricense 37(1): 61-69. ISSN:0377-9424 / 2013 INTRODUCCIÓN Las enfermedades causadas por virus son consideradas un obstáculo para el cultivo del tomate [(Solanum lycopersicum L. (Mill,)] ya que causan pérdidas significativas en la producción. En Bolivia, como lo indica una reciente investi- gación (Plata 2011) el Tomato spotted wilt virus – TSWV, el Tomato cholorotic spot virus – TCSV y el Groundnut rigspod virus – GRSV son los más importantes virus causantes del Tospovirus (virus del bronceado o peste negra), y confirma lo ya indicado por Abad (2005). Similar situación se ha reportado en otros países como Brasil, donde además tienen al Crysanthemum stem necrosis virus – CSNV que afecta al tomate (Lima et ál. 2002, Ferraz et ál. 2004, Lau et ál. 2006). Se debe mencionar que la resistencia gené- tica del tomate al virus TSWV se ha visto en distintas accesiones en el género Lycopersicum (García y Lozoya 2004, Robertson y Labato 2007). Algunos alelos de resistencia se introdu- jeron en cultivares comerciales, como el Rey de los Tempranos que tiene resistencia de Lycoper- sicum esculentum y Stevens que tiene resistencia de L. peruvianum. Estos cultivares son las 2 principales fuentes de resistencia utilizadas en el control genético del TSWV en los programas de mejoramiento en Brasil y otros países (Ferraz 2004, Rodrigues do Nascimento et ál. 2009). La resistencia en el cultivar Stevens es controlado por un gen, denominado Sw-5 con interacción alélica dominante (Rosello et ál. 1998, Stevens et ál. 1992, Juliatti y Maluf 1995), mientras que para el cultivar Rey de los Tempranos la resistencia es controlada por al menos 1 a 3 genes con inte- racción semi-alélica dominante (Juliatti y Maluf 2005, Erico et ál. 2009). Se atribuyeron muchas ventajas a la selección asistida por marcadores moleculares (SAMM) (Moon y Nicholson 2007, Foolad 2007) como efecto de la ausencia del efecto medio ambiental y la independencia del desarrollo de la planta, que es considerado por algunos auto- res como uno de los principales problemas en la selección de resistencia o de plantas inmunes a los virus a través de la selección fenotípica (Lanza et ál. 2000, Ribeiro et ál. 2006). Referente a la resistencia al virus es posi- ble piramidar múltiples alelos de resistencia. En el caso de TSWV, el marcador SCAR SW-421 podría ser una herramienta importante para la SAMM. Varios marcadores moleculares asocia- dos al gene-virus de resistencia se han identifica- do, aunque su uso no ha sido frecuente cuando no están estrechamente asociadas al gen con un alelo interés (Silva et ál. 2003, Santos 2004, Ribeiro et ál. 2006). La distancia entre el Sw-421 y el alelo marcador Sw-5 es menor que 1,0 cM (Stevens et ál. 1991), y esto permite la selección de la Sw-5 alelo con un buen margen de seguridad. Stevens et ál. (1995) desarrollaron el mar- cador UBC-421 de un RAPD (Random amplified polymorphic DNA) que es un iniciador (primer en inglés) decámero (ACG GCC CAC C), el cual mostró una banda a 940 bp (banda 421R) en genotipos resistentes y una banda a 900 bp (banda 421S) en los materiales susceptibles a una pequeña distancia de 1,0 cM del gen Sw-5 con una banda polimórfica de tipo co-dominante; es decir, 2 bandas en los genotipos supuestamente heterocigotos (Stevens et ál. 1996). El marca- dor UBC-421 fue posteriormente convertido en un marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) tipo co-dominante (iniciado- res Sw-421-1 y 421-2 a 20 bp), un trabajo reciente realizado por Rodrigues do Nascimento et ál. (2009), confirmó la herencia co-dominante del marcador Sw-421 al identificar genotipos resis- tentes de tomate en progenies isogénicas segre- gantes. Como Sw-421 muchos otros marcadores moleculares tipo SCAR fueron desarrollados, pero su eficacia aún necesita ser probada en los programas de mejoramiento genético de tomate (Moon y Nicholson 2007, Fooland 2007, Rodri- gues do Nascimento et ál. 2009). Convertir mar- cadores específicos RAPD en marcadores para PCR (Polimeraza Chain Reaction) es deseable porque los marcadores basados en PCR son de fácil uso, menos laboriosos y de bajo costo para ensayar un locus simple y que es más reproduci- ble (Moon 2006, Stevens y Robbins 2007). GABRIEL et ál.: Resistencia genética de híbridos de tomate 63 Agronomía Costarricense 37(1): 61-69. ISSN:0377-9424 / 2013 El objetivo del presente estudio fue eva- luar la resistencia y susceptibilidad de plantas en híbridos de tomate por evaluación fenotípica y del patrón molecular a través del marcador SCAR (Sw-421), que distingue los homocigotos (Sw-5/ Sw-5) y heterocigotos (Sw-5/Sw-5+) resistentes del susceptible (Sw-5+/ Sw-5+). MATERIALES Y MÉTODOS El estudio se realizó en la campaña 2012 en el invernadero y laboratorio de biología mole- cular de la Fundación PROINPA, zona de El Paso, a 15 km de la ciudad de Cochabamba provincia de Quillacollo del departamento de Cochabamba (Bolivia), comprendido entre los paralelos 17°18’ de latitud Sur y 66°14’ de longitud Oeste, a una altitud de 2540 msnm. Se utilizaron 10 híbridos y 2 parentales de tomate obtenidos en el programa de mejoramien- to genético de la Fundación PROINPA (Gabriel et ál. 2012). QTLs y genes de resistencia conocidos Se utilizó el marcador Sw-421 que fue compendiado en una lista de marcadores poten- ciales que están ligados y co-localizados con el gen de resistencia al tospovirus Sw-5 en un mapa referencial de papa y tomate (Tanskley et ál. 1992, Brommonschenkel y Tanksley 1997, Foo- lad 2007, Moon y Nicholson 2007, Rodrigues do Nascimento et ál. 2009). En el Cuadro 1 se descri- be el gen de resistencia a TSWV mientras que en el Cuadro 2 los marcadores en los híbridos para el cribado del gen Sw-5 de resistencia a tospovirus (TSWV) en tomate. Cuadro 1. Genes de resistencia al TSWV del tomate recopilados en 12 cromosomas, intervalo de marcadores flanqueantes (MF) para el gen. Nº Crom Gen MF Factor Referencia 1 IX Sw-5 Sw421 TSWV Rodrigues do Nascimento et ál. (2009), Foolad (2007), Moon y Nicholson (2007), Brommonschenkel y Tanksley (1997). Crom=cromosoma; MF=marcador flanqueante. Cuadro 2. Secuencias de los cebadores utilizados para amplificar los correspondientes marcadores en los híbridos para el cri- bado del gen Sw-5 de resistencia a tospovirus (TSWV) en tomate. Marcador Cebador directo Cebador reverso T° A (°C) Tamaño Protocolo Sw421 GAC TTG TTG CCA TAG GTT CC GCC CAC CCC GAA GTT AAT CC 60 940 bp SCAR SCAR = Sequence Characterized Amplified Region (Secuencia caracterizada de la región amplificada). Extracción de ADN Se colectaron foliolos jóvenes y sanos de 10 híbridos y 2 parentales de tomate, provenien- tes de invernadero y almacenadas a -20ºC. El ADN genómico total fue extraído a partir del material vegetal molido mediante el método CTAB 2X (hexadecil bromuro de trimetil amonio) desarrollado por Doyle y Doyle (1990). La calidad y concentración del ADN obtenido fue evaluado después de la tinción con bromuro de etidio en geles de agarosa al 1% y transluminador UV marca Biorad. AGRONOMÍA COSTARRICENSE64 Agronomía Costarricense 37(1): 61-69. ISSN:0377-9424 / 2013 Condiciones de la PCR Para el análisis de PCR se siguió el proto- colo desarrollado por Rodrigues do Nascimento et ál. (2009) con algunas modificaciones, donde la mezcla de reacción contenía 15 ng de ADN genómico, buffer PCR 10X, 0,2 mM dNTP, 1 pmol.µl-1 de cada iniciador y 0,025 U.µl-1 de la enzima Tag polimeraza. Las condiciones de reacción consistieron en 94ºC por 5 min, 35 ciclos de 94ºC por 1 min, 60ºC por 45 s y 72ºC por 60 s. (T100 Thermal Cycler marca BioRad). Los productos de amplifi- cación fueron separados en geles de agarosa. Análisis de alelos La presencia o ausencia del marcador molecular validado en cada híbrido, se anotó y almacenó en archivos con formato EXCEL para su posterior análisis. Resistencia en plantas Se lavaron 10 semillas de cada uno de los híbridos en investigación con solución de Metil- 1-(butilcarbamoil)-2-bencimidazol-carbamato (Benomyl) y se las colocó en cámara húmeda esto es, cada semilla en una servilleta empapada con agua y se mantuvo cerrado por 6 días a tem- peratura ambiente. Luego se realizó la siembra en un semillero y cuando las plantas alcanzaron un tamaño entre 10 a 12 cm en la cuarta semana de la siembra se transplantaron en macetas de 1½ kg con tierra esterilizada humedecida en inverna- dero. Se fertilizó, regó y controlaron las plagas y enfermedades que podrían afectar a las plantas hasta el momento de la inoculación, mediante un fungicida sistémico con base en Propiconazole y Difenoconazole (Taspa-0,5 cc.l-1) y un insecticida con base en Lambda-cihalotrina (Karate–1 cc.l-1). Inoculación Para el experimento se utilizaron 65 plan- tas sanas de tomate con 90 días de edad distribui- das en 13 sub-grupos de 5 plantas cada una. Para la inoculación del virus se siguió el protocolo recomendado por López et ál. (2003). Como testigos se utilizaron 6 plantas entre las mismas accesiones, las cuales se trataron úni- camente con el abrasivo y el buffer fosfato, y se las mantuvo en otro invernadero durante todo el experimento. Se realizó la serología a 3 plantas infec- tadas y con sintomatología en invernadero, y se confirmó un DAS-ELISA positivo (+) para una única planta, las otras 2 presentaron resultado negativo (-). Con base en estos resultados se volvió a extraer el inóculo solo de la planta con- firmada y se efectuó una segunda inoculación a los 7 días después la primera inoculación y una tercera inoculación a los 9 días. Análisis de la severidad En las plantas inoculadas en invernadero se realizaron evaluaciones de severidad con la escala recomendada por López et ál. (2003) para ubicar las características de severidad de sinto- matología producida por TSWV (Cuadro 3). Cuadro 3. Escala de severidad de sintomatología producidos por TSWV. Escala Características 0 Ausencia de Sintomatología. 1 Leve detención de crecimiento. Epinastía. Moteado y bronceado en hojas. 2 Moderada detención de crecimiento. Epinastía. Mosaico. Anillos necróticos. 3 Severa detención del crecimiento. Aspecto de rigidez. Epinastía. Mosaico. Anillos necróticos. 4 Severa detención del crecimiento. Epinastía. Variegado y clorosis en hojas. Necrosis en hojas y tallos. Los días de evaluación fueron los siguientes: 2, 9, 13, 16, 20, 24, y 34 ddi. GABRIEL et ál.: Resistencia genética de híbridos de tomate 65 Agronomía Costarricense 37(1): 61-69. ISSN:0377-9424 / 2013 Análisis serológico por DAS-ELISA Inoculación El inoculo, con TSWV previamente iden- tificado por DAS-ELISA, se preparó por macera- ción de hojas sintomáticas en una dilución de 1/10 (P/V) en tampón fosfato 0,01 M con Sulfito de Na al 0,1% y pH 7,22 con adición final de carburun- dum. El inoculo se mantuvo en un baño de hielo durante todo el proceso de la inoculación (López et ál. 2003). Se realizó el análisis serológico en 65 plantas inoculadas con síntomas de TSWV y en 5 plantas testigo, mediante el DAS-ELISA (Double Antibody Sándwich – enzyme linked immuno- sorbent assay). Se llevo a cabo un análisis seroló- gico para GRSV y TSCV en las mismas plantas. Se utilizaron antisueros de la línea AGDIA. Se colectaron 2 g de 5 plantas por híbri- do, obteniéndose un total de 14 muestras para la prueba. Para sensibilizar la placa se disolvió 0,146 g de NAHCO3 y 0,079 g de NA2CO3 para 1 l con 0,010 g de NaN3 y finalmente se agregó 100 µl de la gamma globulina purificada y se incubó a 4ºC toda la noche. Preparación de las muestras para su análisis Según protocolo del fabricante la muestra se utilizó en relación 1:4 (Cuadro 4). Se utilizó 100 µl de la muestra diluida y testigos (Blanco y control para TSWV). Se incubó la placa con los antígenos a 4ºC toda la noche, se adicionó el conjugado en dilución 1:200, luego se añadió la enzima-gamma globulina e incubó a 25ºC por 2 h, finalmente el sustrato disuelto en buffer de concentración 0,5 mg.ml-1 se incubó a temperatura ambiente por 30 min. Las lecturas se realizaron a 450 nm en lector de ELISA. RESULTADOS Análisis de la resistencia Los resultados mostraron que los híbridos cuyo padre fue la especie silvestre 70 89R Sw-5/ Sw-5 (Solanum peruvianum) portador del gen Sw-5 en estado homocigoto transfirió exitosamen- te el gen de resistencia a TSWV (Cuadro 5). Cabe mencionar que tampoco se observaron síntomas típicos de GRSV y TCSV, lo cual se confirmó con la prueba de DAS-ELISA que no detectó la presencia de estos virus (Cuadro 5). Se observó que el híbrido PROINPA 7 (Platus x 71 89S LACHING Sw-5) mostró un síntoma leve de atrofiamiento en el crecimiento (escala 1) y fue positivo en la prueba de DAS- ELISA con un valor de 0,139 de absorbancia (Cuadro 5), dicho aspecto indica que este híbrido fue susceptible a TSWV. En cambio, el híbrido PROINPA 6 (Martha x 71 89S LACHING Sw-5), no mostró síntomas de severidad a TSWV, y no reaccionó en la prueba de DAS-ELISA, lo que señala que probablemente éste híbrido tiene algún grado de resistencia y el gen está en estado heterocigótico (Sw-5/Sw-5+) (Cuadro 6), pero si mostró reacción al GRSV y TCRV (Cuadro 5), lo que denota que tuvo susceptibilidad a ambos tipos de virus. Análisis molecular La temperatura de hibridación (Tm) del iniciador al ADN genómico se realizó en una PCR de gradiente, determinándose una Tm de 60ºC como la más optima y en la cual se logró una mejor amplificación, visualizándose la banda de interés para el marcador Sw-421 a los 940 bp. Cuadro 4. Preparación del buffer de maceración. Reactivo Cantidad Sulfito de Sodio 0,195 g PVP 3,0 g Azida de Sodio 0,03 g Albumina de Huevo 0,3 g PBS-tween 1 ml Agua destilada c.s.p 150 ml AGRONOMÍA COSTARRICENSE66 Agronomía Costarricense 37(1): 61-69. ISSN:0377-9424 / 2013 Cu ad ro 5. R ea cc ión de hí br ido s y te sti go s d e t om ate a la ino cu lac ión co n T SW V me dia nte se ve rid ad de si nto ma tol og ía y s ero log ía po r D AS -E LI SA . E l P as o, Co ch ab am ba , 20 12 . Va rie da de s Có dig o Ge ne alo gía Ti po Cr ec im ien to DA S- EL IS A TS W V GR SV TC SV M ad re Pa dr e Ab so rba nc ia Se ve rid ad Re ac ció n PR OI NP A 1 - A nd ini ta 4 x 70 At lan tic o 70 89 R Sw -5/ Sw -5 In de ter mi na do 0,1 40 0 - - - PR OI NP A 2 - A gu aí 11 x 70 Ha lay 70 89 R Sw -5/ Sw -5 In de ter mi na do 0,1 36 0 - - - PR OI NP A 3 - A ram i 32 X 70 Na xo s 70 89 R Sw -5/ Sw -5 In de ter mi na do 0,1 37 0 - - - PR OI NP A 4 - Y ara 35 x 70 Sh an no n 70 89 R Sw -5/ Sw -5 In de ter mi na do 0,1 40 0 - - - PR OI NP A 5 - P int on a 40 x 70 Ar tha lic a 70 89 R Sw -5/ Sw -5 In de ter mi na do 0,0 70 0 - - - PR OI NP A 6 - Ja su ka 41 X 71 M art ha 71 89 S L AC HI NG Sw -5 In de ter mi na do 1,5 02 1 - + + PR OI NP A 7 - R ed on da 2 x 71 Pla tus 71 89 S L AC HI NG Sw -5 De ter mi na do 0,1 39 1 + - - PR OI NP A 8 - C leo pa tra 19 x 70 Ri o G ran de 70 89 R Sw -5/ Sw -5 De ter mi na do 0,1 36 0 - - - PR OI NP A 9 - B on ita 30 X 70 In ca s 70 89 R Sw -5/ Sw -5 De ter mi na do 0,1 43 0 - - - PR OI NP A 10 - Bo la pe ra 36 X 70 Iso la 70 89 R Sw -5/ Sw -5 De ter mi na do 0,0 66 0 - - - Te sti go Sh an no n In de ter mi na do 2,4 40 1 + + + Te sti go s s an os 0,1 47 0 - - - Pa dr e 70 89 R Sw -5/ Sw -5 0,1 37 0 - - - Pa dr e 71 89 5 L AC HI NG Sw -5 0,1 28 1 - - - Bl an co 0,1 44 - - - Co ntr ol (+) 2,2 47 + - - - : R ea cc ión ne ga tiv a, + : R ea cc ión po sit iva , A bs orb an cia : m ed ia bla nc os x2 =0 ,27 2 ( po r e nc im a d e e ste va lor so n p os itiv os) . Se ve rid ad : 0 : A us en cia de sí nto ma s, 5 : Se ve ra de ten ció n d el cre cim ien to. GABRIEL et ál.: Resistencia genética de híbridos de tomate 67 Agronomía Costarricense 37(1): 61-69. ISSN:0377-9424 / 2013 El análisis molecular (Figura 1 y Cua- dro 6) mostró que las variedades PROINPA 2 (Aguaí), y PROINPA 9 (Bonita) tienen el gen de resistencia (R) a TSWV en estado homoci- goto dominante (Sw-5/Sw-5) y se la encontró a los 940 bp. Las variedades PROINPA 1 (Andinita), PROINPA 3 (Arami), PROINPA 4 (Yara), PROINPA 5 (Pintona), PROINPA 6 (Jasuka), PROINPA 8 (Cleopatra) y PROINPA 10 (Bola pera), tienen el gen de resistencia (H) a TSWV en estado heterocigoto (Sw-5/Sw-5+) y se las ubicó entre 900-940 bp. Solamente en la variedad PROINPA 7 (Redonda), el padre 71 89S LACHING Sw-5 y la variedad Shannon, presentaron el gen de susceptibilidad (S) al TSWV en estado homocigoto recesivo (Sw-5+/ Sw-5+) y se la detectó a 900 bp. Cuadro 6. Pares de bases y estado de los genes de las diferentes variedades híbridas de tomate. El Paso, Cochabamba, 2012. Variedad Código Genealogía bp Genes Hembra Macho PROINPA 1 - Andinita 4x70 Atlantico 70 89R Sw-5/Sw-5 900-940 Sw-5/Sw-5+ PROINPA 2 – Aguaí 11x70 Halay 70 89R Sw-5/Sw-5 940 Sw-5/Sw-5 PROINPA 3 – Arami 32X70 NAXOS 70 89R Sw-5/Sw-5 900-940 Sw-5/Sw-5+ PROINPA 4 – Yara 35x70 Shannon 70 89R Sw-5/Sw-5 940 Sw-5/Sw-5+ PROINPA 5 – Pintona 40x70 Arthalica 70 89R Sw-5/Sw-5 900-940 Sw-5/Sw-5+ PROINPA 6 - Jasuka 41X71 Martha 71 89S LACHING SW-5 900-940 Sw-5/Sw-5+ PROINPA 7 – Redonda 2x71 Platus 71 89S LACHING SW-5 900 Sw-5+/Sw-5+ PROINPA 8 – Cleopatra 19x70 Rio Grande 70 89R SW-5/SW-5 900-940 Sw-5/Sw-5+ PROINPA 9 – Bonita 30X70 INCAS 70 89R SW-5/SW-5 940 Sw-5/Sw-5 PROINPA 10 – Bola pera 36X70 ISOLA 70 89R SW-5/SW-5 900-940 Sw-5/Sw-5+ 89R SW-5/SW-5 940 Sw-5/Sw-5 895 LACHING SW-5 900 Sw-5+/Sw-5+ Shannon 900 Sw-5+/Sw-5+ Sw-5/Sw-5: Homocigoto dominante resistente, Sw-5+/Sw-5+: Homocigoto recesivo susceptible, Sw-5/Sw-5+: Heterocigoto resistente, PROINPA 1 al PROINPA 6: Plantas Indeterminadas, PROINPA 7 a PROINPA 10: Plantas Determinadas. 1: Proinpa 1 (Andinita), 2: Proinpa 2 (Aguaí), 3: Proinpa 3 (Arami), 4: Proinpa 4 (Yara), 5: Proinpa 5 (Pintona), 6: Proinpa 6 (Jasuka), 7: Proinpa 7 (Redonda), 8: Proinpa 8 (Cleopatra), 9: Proinpa 9 (Bonita), 10: Proinpa 10 (Bola pera), 11. Parental 89R Sw-5/Sw-5, 12: Parental 895 LACHING SW-5, 13: Shannon; C-: Control negativo de reacción, bp: pares de bases. Fig. 1. La identificación visual de las bandas se realizó en un gel de agarosa al 1,8% en un transluminador UV marca Biorad. AGRONOMÍA COSTARRICENSE68 Agronomía Costarricense 37(1): 61-69. ISSN:0377-9424 / 2013 DISCUSIÓN El método de ADN con el uso de CTAB, fue eficiente y conveniente para la extracción a partir de pequeñas muestras de tejido (Ferreira y Grattapaglia 1998), lo cual se evidenció por el alto nivel diferenciación en las bandas encontra- das con el iniciador utilizado, obteniéndose ADN de buena calidad, libre de contaminantes, libre de ARN, no degradado, y con alto peso molecular. La temperatura de hibridación para la amplifica- ción se ajusto a 60°C, que difiere a los reportados por Nascimento et ál. (2009) y Erico et ál. (2009), lo que es indicativo que se requieren mejoras de los protocolos en cada laboratorio. Cabe mencionar que investigaciones reali- zadas por Boiteux y De Giordano (1993) encon- traron que el mismo gen de resistencia al TSWV le confiere resistencia a GRSV y TCSV, lo cual nos hace ver la gran importancia de incorporar genes de especies silvestres emparentadas con el tomate. En nuestra investigación los análisis han mostrado que aparentemente se ha logrado el control efectivo de los 3 virus con el gen Sw-5 introducido de Solanum peruvianum en algunos de los híbridos evaluados. También se identifica que la enfermedad evoluciona y como solución más práctica se iden- tifica la necesidad de buscar y seleccionar nuevas fuentes de material con resistencia natural contra las nuevas variantes de TSWV. En este sentido, esta investigación ha procurado obtener nue- vas fuentes de resistencia, mediante inoculación mecánica de aislados virales que superan la resis- tencia, en entradas de diferentes especies silves- tres relacionadas con el tomate cultivado (Peralta et ál. 2007). Así, se recomienda ensayar el uso de accesiones de las especies Solanum habro- chaites, S. chilense, S. pennellii, S. peruvianum y S. pimpinellifolium (Peralta et ál. 2007). En el futuro se espera determinar el control genético de estas resistencias para, transferir luego, los genes responsables, a variedades de tomate de interés agronómico. Por otra parte también se observó que la evaluación fenotípica confirmó la eficiencia en el proceso de inoculación y mostro reacción diferencial de los genotipos de acuerdo con la presencia o ausencia del alelo Sw-5. El marcador molecular permitió la identificación de homoci- gotos Sw-5/Sw-5 y heterocigotos Sw-5/Sw-5+ en las plantas resistentes, resultados similares a los encontrados por Rodrigues do Nascimento et ál. (2009) al evaluar progenies isogénicas segregan- tes de tomate. AGRADECIMIENTOS Se agradece al apoyo económico de los proyectos: Fontagro - Desarrollo y valoración de recursos genéticos de Lycopersicon spp., para su utilización en mejoramiento genético de Solaná- ceas frente a estrés biótico y abiótico (ID: 8071) y “Fortaleciendo capacidades de innovación par- ticipativa para luchar contra la pobreza rural” (IP – Holanda). LITERATURA CITADA ABAD J.A., MOYER J.W., KENNEDY G.G., HOLMES G.A., CUBETA M.A. 2005. Tomato spotted wilt virus on potato in Eastern North Carolina. American Journal of Potato Research 82:255-261. BOITEUX L.S., DE GIORDANO L.B. 1993. Genetic basis of resistance against two Tospovirus species in tomato (Lycopersicon esculentum). Euphytica 71:151–154. BROMMONSCHENKEL S.H., TANKSLEY S.D. 1997. Map-based cloning of the tomato region that spans the Sw-5 tospovirus resistance gene in tomato. Mol General Genet 256:121-126. DOYLE J.J., DOYLE J.L. 1990. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus 12:13-15. 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