Cienc. Tec. 7 (1): 69-96, 1983 LA DIFRACTOMETRIA OPITCA APLICADA A LA VIROLOGIA: I. DESCRIPCIDN DE UN DIFRACTOIETRO OPTIC° F. J. SOLEY* FRANCISCO HERNANDEZ** YPIIILET BRENES ** JOSE BRENES * RESUMEN En el proceso de dilucidar la ultraestructura de viriones se pre sentan a menudo problemas en el anglisis de las micrograffas electra- nicas. Dos ejemplos de estos probleras son on nivel de ruido que no, permite distinguir detalles estructurales y la presencia de imggenes de diferentes pianos de la misma particula, que producen figures de "moire". Para obviar estos problemas se han utilizado con exit° algu nos mitodos de la Optica de Fourier, que tambien perriten estudiar a- rreglos simetricos que pasan desapercibidos a simple vista. Con el objeto de aplicar estas tknicas al anglisis ultraestructural de vi- riones, se disend y construyO un difractOmetro Optic°. Estos angIi- sis se estgn aolicando al estudio ultraestructural de los rotavirus, el agente etiologic° mgs importante en la diarrea del nifio menor de dos anos de edad, cuya ultraestructura no se ha dilucidado satisfacto riamente. En este artkulo se describe el difractometro y su metodo de operation. Se describe la obtencion de la transformada de Fourier utilizan- do una fuente de luz puntiforme y se obtienen expresiones pars el au- mento y posiciOn, tanto de la transformada coma de la imagen del obje to. Tambien se analiza el intervalo dingmico del instrumento y se describe un metodo experimental pars determiner la constante instru- *Escuela de Fisica, Universidad de Costa Rica "Instituto de Investigaciones en Salud (INISA), Universidad de Costa Rica "*Unidad de i_croscopia Electronica, Universidad de Costa Pica 70 CIENCIA Y TECNOLOGIA mental. Ademds, se describe el difract6metro, un metodo de alinea- miento y ajuste, y se presentan los patrones de difraccion de obje- tos de geometria sencilla y de rotavirus. SOLEY et al: La difractometria Optica apticada a la viroloda: 71 ABSTRACT During the process of dilucidating the ultrastructure of v.iruses, often the analysis of the micrographs is hampered by high noise lev- els :hat tend to obscure the details, or by the presence of images of different planes of the same particle resulting in a moire pat- tern. Fourier Optics methods have been succesfolly applied to solve these problems. Also, Fourier transforms of micrographs are helpfull in revealing symmetries not easily observable with the naked eye. With the purpose of applying these techniques to the ultrastructural analysis of viruses, we designed and built an optical diffractometer. In particular, the diffractometer is presently used in analyzing rota virus, whose ultrastructure is not known and because they are the most important cause of diarrea in children less than two years old. In this paper we describe the diffractometer and its operation. First we consider a semitransparent object illuminated by a point source and explore the relations between the size and position of the Fourier transform and the object's image as obtained with a lens. The dynamic range of the instrument is analyzed and an experi- mental method to determine its constant is described. Finally, the optical diffractometer and its aiigment procedure are described, and 72 CIENCIA Y TECNOLOGIA a the diffraction patterns of simple geometries and of rotavirus are presented. SOLEY et al: La difractometria optica aplicada a k virologfa: 73 1. INTRODUCCION Los virus esferoides miden de 20 a 200 nm de digmetro y estgn compuestos por un 6- cido nucleico enced(addo dentro de una envoltura proteica denominada cgpsida. La cgpsi- da esta integrada por unidades morfolOgicas o capsomeros, compuestos por unidades es- tructurales, las cuales a su vez estan formadas par subunidades proteicas (1,2). El vi rift adopta una arouitectura icosahedrica (fig. 1.) por razones de estabilidad (a). Algunas familias de virus presentan arreglos ultraestructurales que pueden identi- ficarse por el indite de triangulation (T). Este indite corresponde al nUmero de trign gulos equilateros en que esta subdividida cada una de las facetas triangulaes del icosa hedro, lo que hace mgs apropiado referirse a simetrfas icosadeltanddricas (3). La investigation ultraestructural de virus se ha realizado mediante microscopia eiectrOnica, empleando principalmente metodos de tinciOn negativa con metales pesados. No obsrante, la alta resolucidn que se logra con este metodo, las imggenes obtenidas co rresponden a la superposition de Ta cara superior e inferior de la misma particula. El patrdn de "moire" resultante hace que algunos viriones aparezcan confusos (4,5). Por esta razdn, en el anglisis ultraestructural se han empleado otros metodos, ademgs de la 'microscopia electronica. Entre esos metodos estgn Ta difraccion de rayon X (6) y la di fraction Optica (7). La difraccitin dptica permite obtener el patron de difraccidn de un viricin a partir de una micrograffa electrOnica. Analizando ese patron, se obtiene informaciOn pare di- lucidar el arreglo ultraestructural del virus. En ciertos casos, la difractometria re- vela arreglos simetricos no aparentes a simple vista en las micrograffas. Ademds, es posible filtrar el patron de difracciOn y eliminar las frecuencias espaciales debidas 74 CIENClAYTECNOLOGIA al ruido, para reconstruir ioSgenes mSs claras que la fotografia original. En el caso de superposicitin de imAgenes, las tecnicas de filtrado han permitido separar las caras anterior y posterior de una particula (5). La ultraestructura de los rotavirus, el agente etiologico mgs importante en la diarrea del niao menor de dos efts de edad, ha sido estudiada mediante microscopla ele--, trdnica. Sin embargo, los informes son contradictorios, describi4ndose cinco posibles-- modelos ultraestructurales diferentes (8-12). Posiblemente, algunas de esas COntradiC ciones son debidas al efecto de "moire", que tal vez puedan dilucidarse mediante el ana lisis difractometrico. En este articulo se describe un difractdmetro optico y sus principios de operaci6n, aplicados al andlisis ultraestructural de viriones. II. PRINCIPIOS OE OPERACION En la figura 3, se ilustra el principio de operacidn de un difractometro optic° que utiliza una fuente de luz monocromStica, coherente y puntiforme. La fuente puntiforme FP se coloca a una distancia 0 de la lente L1 de distancia focal fl, que formard una ima gen de la fuente a una distancia 0'. Si entre FP y L1 se coloca un objeto semitransparen te, a una distancia Si de L1, su imagen 11 se formarg a una distancia Si, y con un to lateral de m/ = Si/S1. Sea t(x,y) el coeficiente de transmisidn del objeto y T(u,v) su transformada bidimensional de Fourier, definida de la forma usual: T(u,v) = t(x,y)exp [-2Triux - 27rivy] dxdy (1) Entonces, suponiendo que la irradiancia Io sobre el objeto es constante, la irra- diancia I en los pianos perpendiculares al eje optic() a distancias 0' y Si de L1, es SOLEY et al: La difractometria Optica aplicada a la virologfa: 75 tars dada por las siguientes relaciones: (13) 2 xt Io Kt 1(xt,yt.,01 ) = -7 CT( K ,l (2) I K' K x, Fr' . 2 Io Yi ,j (3) I(xi,y0Si) = [it( m ' 2 ' m1 1 1 En la ecJacion 2, K es la constante del instrumento y esta definida por la si- guien:e reiacicin: K = X(Si - 0') /mi , (4) donde es la longitud de onda de la fuente. La irradiancia I (xt,yt; D') en el piano donde se forma la imagen de la fuente es proportional a la densidad espectral de potencia (ecuacitin 2), por lo Unto este piano se denomina plan() de la transformada. PT. Como en el planto PT las frecuencias espa- ciales (u = xt/K, v = yt /Ki son inversamente proporcionales a la constante del instru- mento K, el tamailo del patron de difraccion es directamente proportional a K. Por otro lado, la ecuacion 3, corresponde al resultado esperado donde la irradiancia en el pla- no de la imagen reproduce al objeto con el aumento lateral apropiado. El filtrado de los patrones de difraccicin se realiza colocando en el piano de la transformada una pantalla de coeficiente de transmision p(xt ,yt ). Baja estas condi clones la irradiancia en el piano de la imagen estarS dada por: (13) CIENCIA Y TECNOLOGIA 2 j T(u,v)p(ku„kv)exp xi Yi 2niu + 2niv m 1 m1 (5) 76 I(xi .y0S*) dudv Notese que si p(xt.yt) = 1, la relaci6n anterior es la antitransformada de t(xi/mi,yi/m/), por lo tanto se recobra la ecuaci6n 3. En la mayoria de los casos el filtrado se realiza con una pantalla opaca con agujeros, que permite el Paso de las fre cuencias espaciales que llevan la informaci6n deseada y que bloquea las frecuencias es- paciales. III. CONSIDERACIONES DE DISE0 A. Aumento y posicidn de la imagen: Usualmente las di5tancias de la fuente y del objeto se ajustan para obtener un valor de la constante K del difractometro lo mayor posible, para que bajo esas condiciones la transformada del objeto se pueda observar a simple vista, y en el caso de filtrado, se facilite la colocacion y alineamiento de la pantalla. De acuer do a la ecuaci6n (4), la constante K es inversamente proporcional al aumento m1, y por lo tanto, I I es usualmente una imagen muy reducida del objeto. Para remediar esta situation, se introduce una segunda lente L2 a una distancia L del piano de la transformada (figura 3). El aumento lateral total M de la imagen I2 y su position estan dadas por las siguientes relaciones: M = f1f2/ (D'f1.-11 -f2)x1 -f2 I (6) SOLEY et al: La difractometrfa optica aplicada a Ia virologia: 77 X'=f2 x1/[(0I+L-f1 -f2)x1 -f 2 2 2 donde X2 es la position 12 referida al punto focal secundario de L2 y xi es la po sicion del objeto 0 referida al punto focal primario de L1. En la mayoria de los casos (D' + L fl - f2) y 0 y por lo tanto se obtiene de la ecuacicin 6 que el valor absoluto de M aumenta conforme aumenta xl. Sin em- bargo, al acercar el objeto 0 a la fuente FP, disminuye la region iluminada y au menta la variation de la irradiancia sobre el objeto. Por lo tanto se prefiere co locar el objeto adyacente a LI, en este caso: xi = -f/ y M y xi obtienen valores independientes de f1: M - f2 (6a) 0' + L - f2 X' = + f2 2 (7a) 0' + L - f2 Tanta 11 como x2 aumentan conforme la lente L2 se acerca al piano de la trans formada PT, o sea, conforme L disminuye. Una distancia conveniente en cuanto a la facilidad de ajuste es tomar I = f2. Se obtiene entonces, que: M '-f2/01' y (6b) X' * f22/1)1 " (7b) (7) 78 CIENCIA Y TECNOLOGIA Notese que para reconstruir la imagen con un aumento M unitario, la distancia focal f2 debe ser igual a D'. En la prgctica esta distancia 0' es usualmente de uno a tres metros. B. Filtrado espacial del rayo laser La fuente puntiforme se obtiene enfacando un rayo laser a traves de una lente L de distancia focal corta. (V4ase la figura 6). Con una lente de alta calidad optica, es posible obtener enfoques cercanos al limite impuesto por difraccitin . Si D es el diametro de la abertura de la lente y f su distancia focal, entances el primer minima del patron de difracci6n caracteristico de aberturas circulares apare cera a una distancia R3 del eje Optic° en el piano focal, donde (13). R B = a IlAf/ID, (3) Y all es el primer cero de Ta funcion Bessel J1. Para una distancia focal f = 16mm y una abertura D = 5mm, se obtiene que RB = 2.5 micrometros para una longitud de on da A = 0.6328 micrOmetros. El rayo laser se filtra espaciaImente colocando una abertura circular en el pia no focal de la lente Lo. Disminuyendo el radio RA de la abertura se aumenta el tervalo de frecuencias filtradas pero a la vez se disminuye el flujo radiante del ra yo. Una buena opci6n es escoger RA = 10 micrOmetros, ya que no disminuye apreciable mente el flujo y permite filtrar las frecuencias espaciales mayores de w = RA/af, que en este caso corresponde a 1 mm-1. SOLEY et al: La difractometria optica aplicada a la virologfa: 79 C. Frecuencias espaciales del objeto El diametro de la lente L I constituye una abertura circular que limita el campo de vision del objeto. Ademas, en la practice es frecuente user aberturas de diame- tro menor, ye sea pare limiter el area efectiva de la lente y eliminar aberraciones, o Bien, para limiter el area que se desea analizar del objeto. En ambos casos se mo difica el patron de difraccitin del objeto, debido a que el patron resultante en el pldno de la transformada es la convolucion de la transformada del objeto con la trans formada de la abertura. El efecta de la convolucidn se puede minimizer si las fre- cuencias espaciales minimas del objeto son mayores que las frecuencias espaciales co rrespondientes al primer o segundo minima de la transformada de la abertura. En el Cuadro I, se muestran las frecuencias espaciales para el primer y segundo minim° del pacrOn de difraccian correspondientes a aberturas circulares de diferentes diametros. CUADRO 1 DIAMETRO PRIMER MINIMO SEGUNDO MINIMO 25.4 mm 0.048 mm- 1 0.088 mm -1 19.0 0.064 0.12 12.7 0.096 0.18 6.4 0.19 0.35 La frecuencia especial maxima del objeto esta limitada par las dimensiones del negativo en el que se registra la transformada, a por las dimensiones de la lente L2 que reconstruye la imagen. Como regla general se acepta que pare reconstruir aceptablemente una imagen, par lo menos se debe mantener la informaciOn contenida SO CIENCIA Y TECNOLOGIA hasta el mAximo del segundo orden. En el cuadro 2, se presentan las frecuencias es paciales maximas para varios valores de la constante K del instrumento bajo la condition que el primer o segundo orden ocurra a una distancia de 10 mm, que es a- proximadamente la mitad de la dimensiOn menor de un negative de 35 mm. CUADRO 2 K PRIMER ORDEN SEGUNDO ORDEN 1 mm2 1.0 mm-1 5 mm 1 2 5 2.5 3 3.3 1.7 En el caso que el objeto sea un negative fotografico, las frecuencias espaciales se pueden aumentar o disminuir, reduciendo o ampliando el negative. La figura 4, mues tra los patrones de difracciOn de una micrograffa de rotavirus en tres tamafies mos- trades en los insertos. Nftese que conforme se disminuye el tamaile del virus, el pa tr5n de Airy se hace ma's evidente y la information correspondiente a la distancia en tre subunidades o entre capsOmeros se pierde paulatinamente. CH. Determinacia experimental de la constante K del difract6metro Una manera expedite de determinar la constante instrumental K. es mediante el patron de difracciOn de una abertura circular (patron de Airy). El recuadro de la figura 5, muestra una fotegrafia ampliada dos veces del oatrOn de una abertura de dig metro D = 3.18 mm. Los digmetros de los minimos Dm estgn relacionados linealmente con los ceros aim de la funciOn Bessel J1, de acuerdo a la siguiente ecuaciOn: SOLEY et al: La difractometrfa Optica aplicada a la virologia: 81 1 2k DM = 70 31m La grafica en la figura 5, corresponde a los digmetros de los minimos medidos de una fotografia ampliada 10 veces. La Linea recta de mejor ajuste para por el origen, lo que indica que el Orden de los mfnimos fue identificado correctamente. La pendiente medida del grgfico fue de 3.80 mm y nor lo tanto Ta constante instru- mental efectiva es de 19 mm2 . Este valor incluye la amoliacidn de Ta fotograffa y entonces, la constante propia del instrumento es de aproximadamente 1.9 mm2. IV. DESCRIPCION DEL DIFRACTOMETRO OPTIC° En la figura 6, se muestra un esquema del equip° utilizado. La fuente de Luz coherente es un ldser de He/Ne Phywe Modelo 08174.90 de 0.5 O 1.0 m vatios. El lgser estg montado sobre un soporte que permite ajustar el piano de base sobre tres puntos. El sistema Optic° de expansion y filtrado espacial del rayo, asf coma el portaobjetos y la lente transofrmadora LI estgn montados en un banco optic° cuyo piano de base tambien se puede ajustar sabre tres puntos. La Tente que forma la fuente puntiforme es un objetivo de microscopio de 10 aumentos, montado en un mecanismo de trasTacion lineal en dos direccidn mutuamente perpendiculares entre sf y al eje optico. En el piano donde se forma la fuente puntiforme se coloca una abertura de microscopio electronic° de 20 micrometros de diametro, pare filtrar es pacialmente el rayo. La abertura estg montada en un mecanismo de traslacion lineal similar al de la lente L0. La lente L1 tiene una distancia focal de 300 mm y un digmetro de 38.1 mm. El portaobjetos permite colocar las micrografias adyacentes a (9) 82 CIENCIA Y TECNOLOGIA la Tente L1. Las distancias tipfcas entre los e/ementos son las siguientes: Entre el 'User y Lo : 120 cm. Entre Lo y L1 : 40 cm. Entre L1 y PT : 350 cm. Los patrones de difraccion se fotograffan con una camara de 35 mm sin lente con pelicula Panatomic Asa 32 o Plus X ASA 125. Los tiempos de exposition varian de 1/32 a 4 segundos. La posici6n de la camera no es crftica, ya que desviaciones del negativo del piano de 1a transformada de haste 1 cm no perjudican la definfcidn de la imagen, debido a la gran distancia entre L1 y la amara. En la reconstruction de imagenes, solo se han hecho medidas preliminares. Se han observado imagenes de buena calidad optica y de aumento unitario con una lente objetivo de teiescopio colocado a 65 cm del piano de la transformada PT. Como la imagen se produce a 450 cm de la lente, es necesario colocar un espejo para doblar la direcci6n del rayo. V. PROCEDIMIENTO PARA EL AJUSTE DEL DIFRACTOMETRO A. Ajuste del laser y de la lente LI El soporte del laser permite ajustes de forma que el rayo sea paralelo a la mesa a una altura adecuada. Se marca el punto donde el rayo incide en una pared, aproxinadamente a 6 m de distancia. Luego se coloca el banco 6ptico y la lente L1 en un soporte. Los tres puntos de ajuste del banco optico se varfan haste que la lente puede recorrer toda la longitud del banco sin que Ta imagen del rayo en la pared se desvfe del punto marcado. La lente LI se coloca en su position fi SOLEY et al: La difractometria optica aplicada a la virologia: 83 nal cerca del extrema del banco ma's aiejado del laser. B. Ajuste de la lente Lo Se coloca la lente L o en el banco, a una distancia de L I de acuerdo con el valor de la constante instrumental deseada. El centro de L0 se hate coin cidir can el eje Optic°, mediante el mecanismo de traslaciin lineal y obser- vando que la imagers del rayo en la pared, no se desplace. C. ColocaciOn de la abertura La abertura se coloca en el eje optic° y en el piano de la fuente punti forme, este es el peso mgs critico. La manera mgs facil do realizarlo es co locanao la abertura en una posiciOn posterior a la fuente puntiforme, donde el rayo emoieza a expandirse. Esto permite un primer ajuste utilizando el me canismo de traslacion lineal y observando la intensidad del rayo que pa.a par esta abertura. Luego se acerca la abertura al plano de la fuente y se obser- ve que se empieza a formar el patron de Airy caracteristico. La posicidin de la abertura se vuelve a ajustar hasta que el centro del patron coincida con el centro de L1. De nuevo se acerca la abertura a la fuente y se ajusta su posicidn. El procedimiento se repite haste que el maxima central del patron de Airy se haya extendido y Ilene toda la lente L1. D. InstaTaciein de la camara fotografica La position del plano de la transformada se pueUe determinar colocando un objeto de transformada conocida, comp una ranura simple o doble o un pa- tron de N lineas delgadas, observando el piano donde el patron de difrac- 84 CIENC1AVTECNOLOGIA + cion tiene mejor definicion, y en esa posicidn se coloca la cdmara, de modo que el negativo coincida con la posicion del piano de la transformada. SOLEY et al: La difractometrfa optica aplicada a la virologfa: 85 VI. RESULTADOS La figura 7 muestra los patrones de difracciOn de una ranura doble, una ranu- ra rectangular y un arreglo de circulos en disposition hexagonal. En el patron de la ranura doble se observan los maximos de interferencia dentro del maxima princi- pal de difracciOn. Los maximos restantes se extienden fuera del negativo debido al alto valor de la constante instrumental. El patrOn de difractiOn de la ranura rec tangular muestra la estrctura tipica de maximos aids separados en la direction para lela a la dimensiOn menor y de maximos menos separados en la direcciOn paralela a la dimensidn mayor de la ranura. Notese que la estructura debido a la altura de las ranuras es tambi6n evidente en el patrOn de la doble ranura. El arreglo de cir culos produce un patron de difracciOn con la misma simetria hexagonal. Si la foto grafTa se observa a un angulo rasante, es posible distinguir seis franjas que Se extienden del centro hacia afuera. El patrOn de difraccion de rotavirus se muestra en la figura 4. Notese en la fotografla inferior la presencia de franjas similares a la del arreglo hexagonal de circulos de la figura 7. En la figura 3 se muestra el patrOn de difraccion de un fragmento de la cgpsida de rotavirus, en el que pueden distinguir dos hexameros, uno en el centro y el otro en la parte inferior; en la estructura de la parte supe- rior izquierda no se distingue claramente si los capsOmeros forman un pentgmero o un hexgmero. Sin embargo, es evidente que el patron de difraccion tiene una sine- tria preponderamentemente hexagonal. 86 CIENCIA Y TECNOLOGIA VII. COMENTARIOS El difract6metro optic° descrito fue disenado y construido en el Laboratorio de Optica y Espectroscopia de la Escuela de Fisica. Su constant.: instrumental de 2.0 mm2 es igual o mayor que las informadas en trabajos previos (14). Ademas el diseno presenta la ventaja que la constante .Instrumental se puede varier dentro de un intervalo amplio, haciendo pequenos cambios en la distancia entre la fuente puntiforme y la lente transformadora. La principal desventaja del diseno son las grandes distancias entre los elementos opticos, que exigen un espacio de trabajo de alrededor de cinco metros y la presencia de dos operadores. Respecto al analisis de los patrones de difracci6n, es obvio que is interpre tac;dn :orrecta del patr6n producido par una estructura compleja, como el rotavi- rus quo aparece en la figura 4, no puede hacerse sin la ayuda de calculos numeri- cos. Para tai efecto se estan desarrollando programas de cmnputaci6n para obtener los patrones de difraccion esperados de acuerdo con los modelos ultraestructurales oropuestos para este virus. Los calculos se twin utilizando la subrutina de la transformada discreta bidimensional de Fourier de la biblioteca IMSL. SOLEY et a]: La difractornetria Optica aplicadavla virologf 87 AGRADECIIIIENTO Este estudio fue financiado por la Vicerrectolia de Investiga- clan de la Universidad de Costa Rica, y tambien radbi6 apoyo del Departamento de Fisica de la Universidad Nacional, de la Unidad de Microscoola Electr6nica y del Instituto de Investipciones en Salud de la Universidad de Costa Rica. Ademis, queremosagradecer la co- laborackin y guia de Ios doctores Hiroshi Akahori / Yoshimichi Kozuka. 88 CIENCIAYTECNOLOGIA BIBLIOGRAFIA 1. Crick, F.H.C. y Watson, J.D., "Structure of Small Viruses.", Nature, 177:473-475, 1956. 2. Caspar, D.L.D. y Klug, A., "Physical Principles in the Construction of Regular Viruses." En Cold Spring Harbor Symposia on Ouantitative Biology, 27: 1-24, 1962. 3. Caspar, O.LD. y Klug, A., "Structure and Assembly of Regular Virus Particles." En: Viruses, Nucleic Acids, and Cancer. Williams and Wilkins Co., Baltimore, p. 27-39, 1963. 4. Kellenberger, E. y Boy de la Tour, E., "Studies on the ilorphopoiesis of the Head of Phage T-even. II Observations on the Fine Structure of Polyheads", J. Ultrast. Res., 13: 343-358, 1965. 5. Mug, A. y De Rosier, D.J., "Optical Filtering of Electron Micrographs: Recons- truction of One-Sided Images". Nature, 212:29-32, 1966. 6. Finch, J. T. y Holmes K.C., "Structural Studies of Viruses". En: Methods in Virology. Maramorosch, K. y Koprowski, H. (editores), Vol. III, p. 351-474, 1967 7. Markham, R., "The Optical Diffractometer". En: Methods in Virology, Maramorosch, K. y Koprowski, H. (editores), Vol. LV, p. 503-529, 1-96 8. Martin, M. L., Palmer, E.L. y Middleton, R.J., "Ultrastructure of Infantile Gastroenteritis Virus." Virology, 68: 146-153, 1975. 9. Stannard, L.M. y Schoub, 8.0., "Observations on the Morphology of two Rotaviruses" J. Gen. Virol., 37:435-439, 1977. 10. Esparza, J. y Gil, F., "A study on the Ultrastructure of Human Rotavirus". Virology, 91: 141-150, 1978. 11. Kogasaka, R., Akihara, M., Horino, K., Chiba, S. y Nakao, T. "A Morphological Study of Human Rotavirus". Arch. Virol., 61:41-48, 1979. 12. Roseto, A., Escaig, J. Delain, E., Cohen, J. y Scherrer, R., "Structure of Rotavirus as Studied by the Freeze-Drying Technique." Virology, 98:471-475, 1979. 13. Klein, M.V., "Optics", Wiley, Nueva York, 1970. 14. De Rosier, D.J. y Klug, A., "Structure of the Tubular Variants of the Head of Bacteriophage T4 (Polyheads)." , J. Mol. Biol. 65:469-488, 1972. SOLEY et al: La difractometria optica aplicada a la virologfa: 89 CAPSOMERO ACIDO NUCLEICO CAPSIDA FIGURA I. Esquema de un virus icosaedrico. La apsida representa una envoltura pars el Scido nucleico y esta formada por unidades morfoldgicas denominadas capsdmeros. En este caso la cepsida adopta un arreglo icosaedrico, o sea una figura compuesta par veinte caras triangulares equilate ras, que presenta un total de dace vertices. 90 CIENCIA Y TECNOLOGIA FIGURA 2. Grumo de rotavirus obtenido de una muestra de heces de un niho con diarrea. Natese el aspecto esferoide de los virus en cuya superficie se aprecia una serie de aguje- ros redondeos. La flecha sehala un vi- ridn vacio en el cual penetraron las solu- ciones de metales pesados con que se tinci la preparacion (Scido fosfotangstico y ace tato de uranilo). Observese el aspect() de rueda que presentan estas particulas, de donde provino el ter- min° rotavirus. La barra indica 70nm, que es el diametro aproximado de estos virus. Li PT L2 0 FP F + Di —I si si 52 s2 91 SOLEY et al: La difractometria eptica aplicada a la virologfa: FEGURA 3. Principio de operacion del difract6metro 6ptico de fuente de luz puntiforme. Para ma's detalles ver el texto. 92 CIENCIA Y TECNOLOGIA FIGURA 4. Patrones de difrac- cci6n de una misma particula de rotavi rus a diferentes au mentos, segdn se in dica en el recuadro de cada fotografia. 250 E E 200 150 100 0 9 0 10 20 30 40 50 60 SOLEY et al: La difractometria Optica apLicada a la virologfa: 93 CEROS DE Ji FIGURA 5. Obtencion grafica de la constante instrumen- tal (K). En el recuadro aparece el patron de Airy de una abertura de 3.18 mm de didme- tro. Los diametros de los minimos se midie- ran a partir de una ampiiacion de esta. Pa- ra mayor detalle consul tar el texto. 94 CIENCLA Y TECNOLOGIA FIGURA 6. Esquema del di fractometro 6ptico. 95 SOLEY et al: La difractometria optica apticada a la virologia: FIGURA 7. Patrones de difraccion de una abertura doble (fotografia superior), abertura rectangular (fotograffa central) y de cTrculos en arreglo hexagonal (fotograffa inferior). 96 CIENCIA Y 'TECNOLOGIA FIGURA 8. Patron de difraccidn de un Tragmenw uc — ,..4 sida de rotavirus (recuadro inferior). Witese el arreglo hexagonal de los maximos principales. ,