i   UNIVERSIDAD  DE  COSTA  RICA   SISTEMA  DE  ESTUDIOS  DE   POSGRADO             PRUEBA  ESBL  DEL  SISTEMA  AUTOMATIZADO  VITEK®  2  DE  BIOMÉRIEUX   COMO  HERRAMIENTA  PARA  LA  DETERMINACIÓN  DEL  FENOTIPO  BLEE  EN   CEPAS  DE  Enterobacter  spp.,  Citrobacter  spp.,  Proteus  spp.,  Morganella  spp.  Y   Klebsiella  aerogenes  AISLADAS  EN  EL  HOSPITAL  MÉXICO  DURANTE  EL  AÑO   2021             Trabajo  final  de  graduación  sometido  a  la  consideración  de  la  Comisión  del   Programa  de  Estudios  de  Posgrado  en  Especialidades  en  Microbiología  para  optar   al  grado  y  título  de  Especialista  en  Bacteriología  Médica           ARIEL  MIRANDA  PADILLA   B44315         Ciudad  Universitaria  Rodrigo  Facio,  Costa  Rica     2023     ii             iii Tabla  de  contenidos     Resumen  ...................................................................................................................  iv   Lista  de  cuadros  ........................................................................................................  v   Lista  de  figuras  .........................................................................................................  vi   Lista  de  abreviaturas  ..............................................................................................  vii   Introducción  ...............................................................................................................  1   Antecedentes  .........................................................................................................  1   Pregunta  de  investigación  ..................................................................................  11   Hipótesis  ..............................................................................................................  12   Objetivos  ..............................................................................................................  13   Objetivo  General  ..............................................................................................  13   Objetivos  Específicos  .....................................................................................  13   Justificación  .........................................................................................................  14   Materiales  y  métodos  ..............................................................................................  15   Resultados  ...............................................................................................................  18   Discusión  y  Conclusiones  ......................................................................................  26   Limitaciones  y  Recomendaciones  .........................................................................  35   Referencias  bibliográficas  ......................................................................................  36   Anexos  .....................................................................................................................  39                 iv Resumen     Las  β-­lactamasas  de  espectro  extendido  (BLEE)  corresponden  a  enzimas  catalíticas   capaces   de   hidrolizar   el   enlace   amídico   del   anillo   betalactámico   de   penicilinas,   cefalosporinas,  con  excepción  de  las  cefamicinas;;  y  los  monobactámicos;;  pero  no  los   carbapenémicos.   Su   acción   es   inhibida   clásicamente   por   el   ácido   clavulánico,   característica  de  la  cual  se  aprovecha  la  mayoría  de  metodologías  utilizadas  para  su   detección,   siendo  estas   validadas   casi   de  manera   exclusiva   para  Escherichia   coli,   Klebsiella   pneumoniae   y  K.   oxytoca.   Particularmente,   la   prueba  ESBL  del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux   emplea   una   combinación   de   oximinocefalosporinas  de  tercera  y  cuarta  generación  únicas  y  con  ácido  clavulánico   para  determinar  un  resultado  negativo  o  positivo  con  base  en  la  reducción  cuantitativa   o   no   del   crecimiento   a   través   de   un   lector   óptico.   No   obstante,   estudios   previos   destacan  la  capacidad  diagnóstica  de  esta  técnica  para  la  detección  de  BLEE  en  otros   Enterobacterales.  Por  lo  que,  para  evaluar  el  uso  extendido  de  este  método  a  otros   miembros   del   orden,   se   recolectaron   97   aislamientos   clínicos   de   la   División   de   Microbiología  del  Laboratorio  Clínico  del  Hospital  México  durante  el  2021  identificados   como  Enterobacter  spp.,  Citrobacter  spp.,  Morganella  spp.,  Proteus  spp.  y  Klebsiella   aerogenes  sospechosos  de  portar  BLEE.  Se  determinó  el  fenotipo  BLEE  mediante  la   prueba   automatizada   y   el   estándar   de   caracterización   fenotípica   definido   por   las   pruebas   epsilométricas   y   de   variante   de   sinergia   de   doble   disco.   Incongruencias   fueron   resueltas  mediante   PCR   dirigida   a   la   detección   de  CTX-­M.   Se   obtuvo   una   concordancia  casi  perfecta  (κ  =  0.80,  IC95%  1.00-­0.60),  una  sensibilidad  del  97%  y  una   especificidad  del  88%  (VPP  =  79%  y  VPN  =  98%)  al  comparar  ambos  resultados.  En   conclusión,   la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux  es   una   herramienta   de   cribado   tiempo   y   costo   efectiva   en   la   determinación   de   este   mecanismo  de  resistencia.  A  su  vez,  un  algoritmo  diagnóstico  es  propuesto  para  ser   integrado  en  la  rutina  del  laboratorio  en  función  de  garantizar  el  máximo  desempeño   y   veracidad   del   resultado  BLEE  en   estos  microorganismos   que   permita   extrapolar   decisiones  terapéuticas  y  epidemiológicas.               v Lista  de  cuadros     Cuadro  1.  Clasificaciones  propuestas  para  las  betalactamasas  bacterianas.  ...........  3   Cuadro   2.  Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux,   las  pruebas   fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así  como  de   las  moleculares  para  las  48  cepas  en  estudio  de  Enterobacter  spp.  aisladas  en   el  Hospital  México  en  el  2021.  ...........................................................................  19   Cuadro   3.   Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux,   las  pruebas   fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así  como  de   las  moleculares  para  las  15  cepas  en  estudio  de  Citrobacter  spp.  aisladas  en  el   Hospital  México  en  el  2021.  ..............................................................................  21   Cuadro   4.   Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux,   las  pruebas   fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así  como  de   las  moleculares  para  las  14  cepas  en  estudio  de  Morganella  spp.  aisladas  en  el   Hospital  México  en  el  2021.  ..............................................................................  22   Cuadro   5.   Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux,   las  pruebas   fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así  como  de   las  moleculares  para  las  12  cepas  en  estudio  de  Klebsiella  aerogenes  aisladas   en  el  Hospital  México  en  el  2021.  ......................................................................  23   Cuadro   6.   Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux,   las  pruebas   fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así  como  de   las   moleculares   para   las   8   cepas   en   estudio   de  Proteus   spp.   aisladas   en   el   Hospital  México  en  el  2021.  ..............................................................................  24   Cuadro  7.  Evaluación  de   la  concordancia  y   la  capacidad  diagnóstica  de   la  prueba   ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux  para  la  detección  de   BLEE  en   31   cepas   de  Enterobacterales   productoras   de   esta   enzima   y   66   no   productoras,  aisladas  en  el  Hospital  México  durante  el  año  2021,  con  base  en  el   estándar  de  referencia.  ......................................................................................  25     vi Lista  de  figuras     Figura  1.  Esquema  de  distribución  de  los  discos  de  antibióticos  a  utilizar  en  la  prueba   variante  de  sinergia  de  doble  disco.  ..................................................................  16   Figura   2.   Propuesta   de   algoritmo   a   utilizar   en   la   División   de   Microbiología   del   Laboratorio  Clínico  del  Hospital  México  para  la  determinación  del  fenotipo  BLEE   en   aislamientos   clínicos   identificados   como   Klebsiella   aerogenes   o   pertenecientes  a   los  géneros  Enterobacter,  Citrobacter,  Morganella  y  Proteus.  ...........................................................................................................................  31                                                     vii Lista  de  abreviaturas         AMC       Amoxicilina-­Ácido  clavulánico   ATM       Aztreonam   BLEE  (ESBL)     β-­lactamasa  de  Espectro  Extendido   CAZ       Ceftazidima   CMI       Concentración  Mínima  Inhibitoria   CT/CTL     Cefotaxima/Cefotaxima-­Ácido  clavulánico   CTX       Cefotaxima   FEP       Cefepima   PCR       Reacción  en  Cadena  de  la  Polimerasa   PM/PML     Cefepima/Cefepima-­Ácido  clavulánico   TZ/TZL     Ceftazidima/Ceftazidima-­Ácido  clavulánico                                           viii   1 Introducción     Antecedentes     La   producción   de   betalactamasas   corresponde   a   uno   de   los   mecanismos   más   importantes  de  resistencia  a  los  betalactámicos  en  enterobacterales.  Estas  enzimas   se   caracterizan   por   su   producción   de   tipo   constitutiva   o   inducible.   Además,   se   distinguen   según   se   codifiquen   por   genes   que   pueden   encontrarse   en   elementos   genéticos  móviles,  denominadas  como  clásicas  si  son  de  naturaleza  plasmídica,  o  en   el   cromosoma   como   las   que   se   presentan   en   Yersinia   enterocolitica,   Klebsiella   oxytoca  y  Citrobacter  koseri  probablemente  derivadas  de  las  PBP  por  su  similitud  en   secuencia  y  estructura  (García,  de  la  Gándara  &  García,  2010).       En  específico,  las  β-­lactamasas  de  espectro  extendido  (BLEE  o  ESBL,  por  sus  siglas   en   inglés)   se   definen   como   enzimas   catalíticas   capaces   de   hidrolizar   el   enlace   amídico  del  anillo  betalactámico  de  penicilinas,  cefalosporinas,  con  excepción  de  las   cefamicinas;;  y  los  monobactámicos;;  pero  no  los  carbapenémicos.  Su  acción  depende   de   la   cantidad   de   enzima   producida   y   es   inhibida   clásicamente   por   el   ácido   clavulánico,   sulbactam   y   tazobactam   (García   et   al.,   2010;;   Polsfuss   et   al.,   2012;;   Brolund,  2014;;  Urquizo,  Arce  &  Alanoca,  2018).       Otros   inhibidores   como   el   avibactam,   el   vaborbactam   y   el   relebactam   han   sido   aprobados  en  la  última  década  por  la  agencia  estadounidense  de  Administración  de   Medicamentos  y  Alimentos  (FDA,  por  sus  siglas  en  inglés)  en  un  intervalo  de  tiempo   menor   a   los   cuatro   años.   Principalmente,   como   respuesta   a   la   necesidad   de   implementar   nuevas   alternativas   de   tratamiento   a   través   de  moléculas   con   efecto   sinérgico   con   distintos   antibióticos   dirigidos   a   ampliar   la   efectividad   de   estos   inhibidores  más  allá  de   las  BLEE.  Por  ejemplo,  contra  betalamactasas   tipo  AmpC,   metalobetalactamasas  y  otras  carbapenemasas  (Riveros  et  al.,  2021).     Sin   embargo,   recientemente   se   han   encontrado   cepas   de   bacterias   resistentes   a   estos  nuevos  inhibidores  comercializados.  Por  lo  tanto,  otras  nuevas  moléculas  como   el  nacubactam,  el  zidebactam,  el   taniborbactam,  el  QPX  7728  y   las   rodaninas  han   sido  desarrolladas  y  en  su  mayoría  se  encuentran  actualmente  en  fase  experimental;;   2 pero  con  un  avance  pobre  en  cuanto  a  sus  pruebas  en  fase  clínica  (Riveros  et  al.,   2021).     La  definición  propuesta  por  Giske  y  colaboradores   (2009)  divide  estas  enzimas  en   tres  grandes  grupos:  ESBLA,  ESBLM  y  ESBLCARBA.  Las  ESBLM  corresponden  al  grupo   misceláneo  donde  las  AmpC  adquiridas  son  el  tipo  más  común,  mientras  que  en  las   ESBLCARBA  se  delimitan   las  enzimas  con  actividad  carbapenemasa.  Por  último,   las   ESBLA   incluyen   las   enzimas   más   frecuentemente   encontradas,   de   transmisión   horizontal  y  degradadas  por  ácido  clavulánico  como  lo  son  las  SHV,   las  TEM  y  las   CTX-­M  (Brolund,  2014).     Por   otra   parte,   Urquizo   y   colaboradores   (2018)   detallan   una   clasificación   de   las   betalactamasas  basadas  en  el  peso  molecular,  el  espectro  y  grado  de  homología  de   las  secuencias  de  aminoácidos.  Esta  categorización  según   los  criterios  de  Ambler,   Jaurin  y  Grundström  (Cuadro  1)  encasillan  estas  enzimas  dentro  de  las  clases  A  y  D.   Las   de   Clase   A   corresponden   a   enzimas   serinas   con   actividad   preferentemente   penicilinasa  como  SHV,  TEM,  CTX-­M  y  otras  BLEE  menores  tipo  PER,  GES  y  VER.   Además,  esta  clase  incluye  serincarbapenemasas  cromosomales  como  SME  e  IMI-­1   o  plasmídicas   como  KPC-­2.  Esta  última   identificable  por   su   inhibición  por  el   ácido   borónico  y  no  por  el  clavulánico  (Bariani,  2015).  En  la  Clase  D  o  enzimas  serinas  que   hidrolizan  oxacilina  se  encuentran  las  de  tipo  OXA  de  espectro  extendido  (Urquizo  et   al.,  2018).     Fuera   del   espectro   de   enzimas   tipo   BLEE,   otras   clases   como   la   C   de   Ambler   concentra   enzimas   cromosomales   o   plasmídicas   denominadas   AmpC   capaces   de   hidrolizar   penicilinas,   cefalosporinas,   cefamicinas   y   monobactámicos   que   no   son   inhibidas  por  los  compuestos  clásicos  de  las  BLEE.  Al  mismo  tiempo,  las  de  clase  B   plasmídicas  o  metalobetalactamasas  poseen  actividad   contra   los   carbapenémicos,   pero  no  contra  los  monobactámicos  y  son  inhibidas  por  quelantes  de  iones  metálicos   como  el  EDTA  o  el  ácido  dipicolínico  debido  a  que  poseen  al  menos  un  átomo  de  Zinc   en  su  sitico  activo  (Bariani,  2015).     Asimismo,   otras   clasificaciones   como   la   de   Bush–Jacoby   y   Medeiros   (Cuadro   1)   consideran   aparte   de   los   criterios   anteriormente   mencionados,   otros   como   la   3 codificación   cromosómica   o   plasmídica,   el   espectro   de   hidrólisis   y   el   de   inhibición   hacia   clavulánico,   cloxacilina,   sulbactam,   aztreonam   y   ceftazidima.   Empero,   otras   variables  como  el  punto   isoeléctrico  o  el  sitio  activo   también  son  propuestas  como   criterios  de  agrupación  (Urquizo  et  al.,  2018).     Cuadro  1.  Clasificaciones  propuestas  para  las  betalactamasas  bacterianas.   Bush-­  Jacoby   -­  Madeiros   Ambler   Sustratos  preferidos   Enzimas   representativas   1   C   Cefalosporinas   AmpC   de   bacterias   Gramnegativas,  MIR-­1   2a   A   Penicilinas   Penicilinasas   de   bacterias  Grampositivas   2b   A   Penicilinas,   Cefalosporinas   TEM-­1,  TEM-­2,  SHV-­1.   2be   A   Penicilinas,   Cefalosporinas,   Cefalosporinas   de   tercera   generación,   Monobactámicos   TEM-­3   a   TEM-­29,   TEM-­ 42,   TEM-­46   a   TEM-­49,   TEM-­52  a  TEM-­57,  TEM-­ 59   a   TEM-­61,   SHV-­2   a   SHV-­9,  SHV-­12   y  K1  de   K.  oxytoca   2br   A   Penicilinas   TEM-­30  a  TEM-­41,  TEM-­ 44   a   TEM-­45,   TEM-­50,   TEM-­51,   TEM-­58,   TEM-­ 59  y  SHV-­10   2c   A   Penicilinas,   Carbenicilinas   PSE-­1  a  PSE-­3   2d   D   Penicilinas,  Cloxacilinas   OXA-­1  a  OXA-­21   2e   A   Cefalosporinas   Cefalosporinasas   inducibles  de  P.  vulgaris   2f   A   Penicilinas,   Cefalosporinas,   Carbapenémicos   NMC-­A   de   E.   cloacae,   SME-­1  de  S.  marcescens   4 3   B   Betalactámicos  en   general,  incluyendo   Carbapenémicos   VIM,  IMP,  SPM,  NDM   4   No   determinado   Penicilinas   Penicilinasa   de   Burkholderia  cepacia   Fuente:  Modificado  de  Bush  et  al.,  1995;;  Bariani,  2015.     Históricamente,   la  primera  aparición  de  las  betalactamasas  fue  en  1963  cuando  se   aislaron  TEM-­1,  SHV-­1  y  PSE-­1  en  cepas  de  Escherichia  coli  (Urquizo  et  al.,  2018).   Sin  embargo,  el  capítulo  reciente  de  las  BLEE  inició  en  Alemania  en  la  década  de  los   ochenta  con  la  identificación  de  una  SHV-­2,  la  cual  debe  su  nombre  a  la  variación  en   el   grupo   sulfhidrilo   que   le   confiere   su   espectro   de   resistencia   a   penicilinas   y   cefalosporinas  (Coral  et  al.,  2020).       No  mucho   tiempo   después,   con   un   fenotipo   semejante   al   anterior   de   hidrólisis   de   cefalosporinas   de   más   alto   espectro,   y   con   mayor   actividad   frente   a   ceftazidima   (Navarro  et  al.,  2011),  se  describió  en  Francia  una  TEM-­3.  Familia  cuya  denominación   deriva  del  nombre  Temoneira,  paciente  de  nacionalidad  griega  de  quien  se  aisló  por   primera  vez  un  microorganismo  portador  de  esta  enzima  en  1965  (Coral  et  al.,  2020).               Para  el  final  de  la  década,  se  detectó  en  una  cepa  de  E.  coli  con  una  enzima  diferente   de  TEM  y  SHV  que  se  denominó  como  CTX-­M-­1  debido  a  su  preferencia  en  hidrolizar   cefotaxima,   la  cual  se  presume  deriva  de  penicilinasas  cromosómicas  naturales  de   Kluyvera  spp.  en  un  proceso  que  involucra  fagos  y  secuencias  de  inserción  para  su   salto  a  plásmidos  (Farber  et  al.,  2008).  Al  terminar  el  siglo,  de  manera  simultánea  ya   muchos   países   a   lo   largo   del  mundo   reportaban   las   primeras  CTX-­M   adquiriendo   relevancia  epidemiológica  por  su  rápida  dispersión  y  su  aislamiento  en  casi  todas  las   enterobacterias  (García  et  al.,  2010,  Navarro  et  al.,  2011;;  Coral  et  al.,  2020).       Según  Coral  y  colaboradores  (2020),  hasta  el  2016  se  conocían  180  variantes  de  TEM   en   su   mayoría   BLEE,   aproximadamente   237   para   SHV   y   más   de   210   CTX-­Ms   clasificadas  en  6  grupos;;  pero  cuya  cifra  sigue  en  constante  crecimiento  (García  et  al,   2010).  Asimismo,  estos  autores  exponen  que  a  pesar  de  la  continua  descripción  de   nuevas   BLEE   como   PER,   VEB,   GES,   SFO,   TLA,   BEL,   BES   e   IBC;;   las   más   5 ampliamente   distribuidas   en   la   actualidad   son   TEM-­4,   TEM-­24,   TEM-­52,   SHV-­12,   CTX-­M-­14,   CTX-­M-­3,   CTX-­M-­32,   CTX-­M-­9   y   CTX-­M-­15,   siendo   esta   última   la   de   mayor  prevalencia  (García  et  al.,  2010;;  Coral  et  al.,  2020).     De  manera  puntual,  el  principal  orden  bacteriano  asociado  con  la  producción  de  BLEE   y   la   reserva   de   genes   de   resistencia   en   general   por   su   desempeño   como   colonizadores  del  tracto  gastrointestinal  es  el  de  Enterobacterales.  El  espectro  clínico   de  las  infecciones  provocadas  por  estas  bacterias  abarca  desde  las  del  tracto  urinario   y  gastrointestinal  hasta  neumonías  y  del  sistema  nervioso  central,  e  incluso  algunas   más  severas  y  mortales  como  las  del  torrente  sanguíneo.  Infecciones  para  las  cuales   los  antibióticos  β-­lactámicos  son  ampliamente  utilizados  como  tratamiento,  aparte  de   su  uso  profiláctico  en  procesos  quirúrgicos  (Brolund,  2014).   Estos   fenotipos   multidrogo   resistentes   que   usualmente   se   presentan   en   Enterobacterales   productoras   de   BLEE   provocan   el   descarte   de   otros   principales   tratamientos  empíricos  como  las  fluoroquinolonas,  aminoglucósidos  y  la  trimetoprima-­ sulfametoxazol   para   pacientes   severamente   enfermos,   lo   cual   limita   entonces   las   opciones   terapéuticas   e   incrementa   la  morbilidad   y  mortalidad   asociada   (Brolund,   2014;;  Singh  &  Singh,  2014).  Por  lo  que,  para  un  pronóstico  favorable  en  los  pacientes   con  infecciones  severas  que  requieren  un  tratamiento  temprano  y  adecuado,  en  un   contexto  donde  los  procedimientos  diagnósticos  son  muy  lentos,  el  conocimiento  de   la   epidemiología   local,   así   como   la   implementación   de   estrategias   de   intervención   oportunas   son   indispensables   para   un   abordaje   exitoso   de   estas   infecciones.   Estrategia  que  por  supuesto,  incluye  un  tratamiento  empírico  adecuado  (Spanu  et  al.,   2006;;  Brolund,  2014).     La  producción  de  β-­lactamasas  de  espectro  extendido  constituye  además  una  carga   para  los  sistemas  de  salud,  primordialmente  de  índole  económica.  De  hecho,  en  un   estudio   publicado   por   Villanueva   (2017)   se   concluye   que   para   Latinoamérica   en   general  la  atención  de  cada  caso  de  infección  urinaria  BLEE  positivo  cuesta  alrededor   de  2  mil  dólares  entre  gastos  que  involucran  la  prescripción  de  antimicrobianos  y  la   extensión   de   las   estancias   hospitalarias   de   los   pacientes   a   quienes   afectan.   De   manera   que,   conforme   la   transmisión   nosocomial   resulta   más   común,   al   mismo   tiempo  que  se  incrementa  la  tasa  de  portadores  dentro  de  la  población,  el  riesgo  de   6 infectarse   con   cepas   productoras   de  BLEE   también   aumenta   (García   et   al.,   2010;;   Brolund,  2014).     La   transmisión   de   genes   codificantes   para   enzimas   BLEE   ocurre   por   clones   bacterianos   emergentes   mayoritariamente   asociados   con   TEM   y   SHV.   Asimismo,   esta  dispersión  puede  también  responder  al  fenómeno  de  transferencia  horizontal  de   genes  entre   bacterias   de   la  misma  o  diferentes   especies   a   través  de  plásmidos  o   integrones   que   pueden   contener   genes   de   resistencia   contra   muchas   clases   de   antibióticos   como   el   caso   de   las   CTX-­M   y   los   genes   blaBLEE   (García   et   al.,   2010;;   Brolund,  2014).       Los  factores  de  riesgo  para  la  adquisición  de  infecciones  por  microorganismos  BLEE   positivos   son  múltiples.   Urquizo   y   colaboradores   (2018)   señalan   principalmente   al   proceso   de   selección   de   cepas   resistentes   por   el   uso   empírico   de   antibióticos   de   amplio   espectro   que   con   frecuencia   son   administrados   a   pacientes   gravemente   enfermos.  Sin  embargo,  otras  variables  como  la  adquisición  nosocomial,  el  sondaje   urinario,   la   enfermedad   prostática,   las   infecciones   urinarias   recurrentes,   la   edad   avanzada,  el  uso  de  catéter  vesical  o  incluso  la  residencia  en  instituciones  han  sido   justificados   también  como  marcadores  predictivos.  Por   tanto,   es  posible  desmentir   que   la   producción  de  estas  enzimas  es  exclusiva  de   infecciones  nosocomiales   en   pacientes   con   enfermedades   debilitantes   y   con   largas   estancias   hospitalarias.   Es   decir,  actualmente  estas  infecciones  también  ocurren  en  pacientes  ambulatorios.       El   informe   sistemático   de   la   presencia   de   BLEE   detectadas   en   aislamientos   bacterianos  del  orden  de  los  Enterobacterales  a  partir  de  muestras  clínicas  resulta  útil   (CLSI)  o  inclusive  obligatorio  (EUCAST)  en  el  planteamiento  de  trabajo  de  cualquier   laboratorio  microbiológico  bajo  los  propósitos  del  adecuado  control  de  infecciones  y   del   conocimiento   de   la   epidemiología   local   (Singh   &   Singh,   2014).   No   obstante,   diferentes   estudios   realizados   en   América   y   Europa   demuestran   que   aproximadamente  la  mitad  de  los  centros  encargados  del  desarrollo  de  estos  análisis   no  reportan,   identifican  o   interpretan  correctamente  este  mecanismo  de  resistencia   (Simon  &  Glupczynski,  2008).     7 La   gran   mayoría   de   metodologías   descritas   para   la   detección   microorganismos   productores  de  BLEE  en  el  laboratorio  de  microbiología  se  basan  en  la  inhibición  de   estas   enzimas   por   el   ácido   clavulánico,   principalmente,   o   de   otros   inhibidores.  No   obstante,  estos  procedimientos  han  sido  diseñados  de  manera  limitante  únicamente   para  E.  coli  y  Klebsiella  debido  a  la  complejidad  que  representa  su  determinación  en   enterobacterias   portadoras   de   AmpC   plasmídicas   o   productoras   de   AmpC   cromosómicas   cuya   presencia   o   desrepresión   suele   enmascarar   la   presencia   de   BLEE  (García  et  al.,  2010).       Por  tanto,  García  y  colaboradores  (2010)  recomiendan  que  independientemente  del   método  seleccionado  para  el  estudio  de  producción  de  BLEE  en  enterobacterales  se   debe  analizar  el  perfil  de  sensibilidad  a  los  antimicrobianos  en  conjunto  con  la  lectura   interpretada  o  sistema  experto  avanzado  que  permita  detectar  fenotipos  compatibles   con  la  presencia  de  estas  enzimas.  Esto  debido  a  que  para  determinar  este  tipo  de   resistencia   primero   se   debe   sospechar   su   presencia,   primordialmente   debido   al   surgimiento   de   otros   mecanismos   de   resistencia   a   los   betalactámicos   como   alteraciones  en  la  permeabilidad  de  la  pared  bacteriana  o  la  desrepresión  de  bombas   de  expulsión,  las  cuales  a  pesar  de  no  compartir  aún  el  fenotipo  de  las  BLEE  nunca   deberá  menospreciarse  su  control.       Los   sistemas  automatizados  mayoritariamente   distribuidos  generan  alertas   de  una   probable  producción  de  BLEE  en  los  aislamientos  de  microorganismos  en  estudio.  De   manera   diferenciada,   unos   incrementan   su   sensibilidad   al   incluir   diferentes   combinaciones   de   cefalosporinas   con   ácido   clavulánico,   siendo   aquellos   que   incorporen  la  cefepima  los  más  capaces  de  detectar  BLEE  en  una  mayor  cantidad  de   géneros  bacterianos.  No  obstante,  es  necesario  considerar  que  los  múltiples  estudios   en  los  cuales  se  pretende  evaluar  su  fiabilidad  se  han  obtenido  resultados  tan  diversos   como  los  sistemas  analizados  (García  et  al.,  2010).       El  VITEK®  2  ESBL  de  bioMérieux  consiste  según  casa  comercial,  en  una  prueba  de   confirmación   para   las   BLEE   inhibidas   por   ácido   clavulánico   que   utiliza   bajas   concentraciones   de   cribado   de   cefepima   (1.0   mg/L),   cefotaxima   (0.5   mg/L)   y   ceftazidima  (0.5  mg/L)  únicas  y  en  combinación  con  ácido  clavulánico  (10,  4  y  4  mg/L,   respectivamente)   para   determinar   un   resultado   negativo   o   positivo   (bioMérieux,   8 2020).  En  donde,  una  reducción  cuantitativa  del  crecimiento  detectada  por  el   lector   óptico  en  los  pocillos  que  contienen  cefalosporina-­ácido  clavulánico  en  comparación   con  aquellos  que  solo  cuentan  con  una  cefalosporina  es  considerado  como  indicativo   de  la  producción  de  BLEE  (Robin  et  al.,  2007).       De  hecho,  Spanu   y   colaboradores   (2006)   describen  esta   prueba   como  una  nueva   herramienta  para  la  rápida  detección  de  BLEE  cuyos  resultados  finales  se  obtienen   en  diez  horas  menos  en  promedio  que  con  los  ensayos  confirmatorios  o  de  tamizaje   aprobados  por   el  CLSI   (Instituto  de  Estándares  Clínicos   y   de  Laboratorio,   por   sus   siglas  en  inglés).  Sin  embargo,  dentro  de  las  especificaciones  del  inserto  su  indicación   de  uso  se  restringe  a  E.  coli,  K.  pneumoniae  y  K.  oxytoca  según  lo  establece  la  FDA.   Adicionalmente,   de   manera   explícita   recomiendan   llevar   a   cabo   un   método   de   confirmación   diferente   antes   de   informar   una   cepa   como   productora   de   BLEE   utilizando  esta  prueba  (bioMérieux,  2020).       En  cuanto  a  las  pruebas  fenotípicas  de  confirmación  de  BLEE,  el  método  de  difusión   en  agar  con  discos  o  microdilución  en  caldo  para  evaluar  la  sensibilidad  a  cefotaxima   y  ceftazidima  con  y  sin  ácido  clavulánico  corresponde  al  procedimiento  recomendado   por   el   CLSI.   No   obstante,   en   la   práctica   este   puede   ser   sustituido   por   los   procedimientos   de   sinergia   de   doble   disco   o   de  Epsilon-­test®   sólido   (García   et   al,   2010;;  Garrec  et  al.,  2011;;  Polsfuss  et  al.,  2012;;  Singh  &  Singh,  2014).  Los  métodos   moleculares  se  encuentran  disponibles  pero  orientados  a  la  investigación  o  estudios   epidemiológicos  pues  no  se   consideran  apropiados  para   la  detección  de   rutina  de   producción  de  BLEE  en  la  clínica  (Spanu  et  al.,  2006).       La  prueba  de  sinergia  de  doble  disco   fue   la  primera  metodología  en  ser  planteada   para  el  tamizaje  de  cepas  productoras  de  BLEE.  Se  basa  en  la  ampliación  del  halo   de   inhibición   de   los   discos   de   cefotaxima,   ceftazidima   y   aztreonam   colocados   alrededor   del   de   amoxicilina-­ácido   clavulánico   (20   μg/10   μg)   en   un   medio   sólido   (García  et  al,  2010;;  Garrec  et  al.,  2011;;  Polsfuss  et  al.,  2012;;  Singh  &  Singh,  2014).   En  detalle,  los  discos  deben  emplearse  con  una  carga  estándar  de  30  μg  y  separados   por  30  mm  entre  sí.  Sin  embargo,  si  el  resultado  de  la  prueba  es  negativo  y  persiste   la   sospecha   en   una   cepa   identificada   como   E.   cloacae   se   podrá   aumentar   la   sensibilidad  de  esta  al  disminuir  a  20  mm  esta  distancia  entre  los  discos.  Asimismo,   9 aumentar  la  distancia  a  45  mm  podría  ayudar  a  detectar  niveles  bajos  de  expresión   BLEE  en  aislamientos  de  P.  mirabilis.  Por  tanto,  esta  metodología  es  dependiente  de   la  habilidad  en  el  montaje  y  en  la  interpretación  del  usuario  (García  et  al.,  2010).   Las  tiras  de  Epsilon-­test®  representan  por  su  parte  un  método  mucho  más  sencillo,   pero  mucho  más  costoso  entre  sus  similares  para  la  detección  de  BLEE.  Este  estudio   de   confirmación   consiste   en   un   conjunto   de   tiras   de   Etest®   que   contienen   un   gradiente  de  concentración  de  cefotaxima,  ceftazidima  y/o  cefepima  en  uno  de  sus   extremos  mientras  que  en  el  otro  esta  concentración  creciente  de  cefalosporinas  se   encuentra  asociada  a  una  concentración  constante  de  ácido  clavulánico  (4  μg/mL).   Durante   la   lectura   es   importante   seguir   reglas   para   la   determinación   de   las   concentraciones  mínimas  inhibitorias  (CMI)  pues  de  no  ser  así  la  sensibilidad  de  la   prueba   se   ve   comprometida   y   se   observarán   discrepancias   (García   et   al.,   2010;;   Garrec  et  al.,  2011;;  Singh  &  Singh,  2014).   Para   ambos   métodos   se   recomienda   efectuar   pequeñas   modificaciones   según   contextos  específicos.  El   caso  más  común  se  delimita  a   la  detección  de  BLEE  en   cepas   productoras   de   AmpC   como   lo   son   Enterobacter,   Serratia,   Providencia,   Morganella   morganii,   Citrobacter   freundii   y   potencialmente   cualquier   otra   enterobacteria  por  adquisición  de  plásmidos.  Para  estos  aislamientos,  se  sugiere  la   inclusión  de  una  cefalosporina  de  cuarta  generación  como   la  cefepima  pues  estas   betalactamasas  de  tipo  AmpC  generalmente  la  hidrolizan  en  menor  medida  que  las   BLEE,  aun  cuando  estas  últimas  muestran  actividad  mínima  contra  esta  cefalosporina   (García   et   al.,   2010).   Es   decir,   que   la   expresión   de   estas   cefalosporinasas   enmascarara   la   sinergia   entre   cefalosporinas   de   tercera   generación   normalmente   utilizadas  y  el  ácido  clavulánico,   lo  cual  es  un  requisito  para  la  detección  de  BLEE.   Por  tanto,  la  prueba  estándar  no  resulta  útil  (Stuart  et  al.,  2011).     Stuart  y  colaboradores  (2011)  añaden  que  esta  prueba  variante  para  la  detección  de   BLEE   en   enterobacterias   con   AmpC   inducible   de   por   sí   no   tiene   consecuencias   terapéuticas  en  la  práctica  debido  a  que  los  clínicos  consideran  las  cefalosporinas,  y   por  ende  la  cefepima,  inadecuadas  para  el  tratamiento  de  infecciones  causadas  por   estas   especies.   Esta   razón   explica   por   qué   existe   escasa   información   de   la   prevalencia  de  BLEE  en  estos  casos.  Además,  en  Costa  Rica  el  uso  de  cefepima  se   restringe  por  su  exclusión  de  la  Lista  Oficial  de  Medicamentos  del  Seguro  Social  y  la   10 alta  precaución  que  su  uso  supone  en  relación  con  las  consecuencias  de  un  efecto   inóculo   (Caja   Costarricense   del   Seguro   Social,   2014;;   Hospital   Clínico   San   Borja   Arriarán,  2019).     No   obstante,   Ruiz   (2013)   visibiliza   la   cefepima   como   una   opción   de   tratamiento   empírico  debido  a  que  se  ha  visto  que  su  uso  desplaza  cepas  productoras  de  AmpC   por  no  productoras,  lo  cual  se  explica  por  ser  poco  hidrolizado  por  la  enzima  y  por  su   pobre   capacidad   inductora   de   AmpC   con   respecto   a   otros   antibióticos   como   los   carbapenémicos,   los  cuales  son   los  antibióticos  recomendados  como  primera   línea   para   el  manejo   dirigido   de   estas   infecciones   (Hospital   Clínico   San   Borja   Arriarán,   2019).     Esta  recomendación,  a  su  vez,  se  fundamenta  según  Aguilar  (2016)  debido  a  la  alta   estabilidad   de   estos   agentes   ante   la   hidrólisis   ocasionada   por   las   BLEEs   y   su   excelente   distribución   entre   los   tejidos   corporales   que   les   permite   alcanzar   altas   concentraciones  sin  el  efecto   inóculo.  Es  decir,  sin  el  aumento  de   la  concentración   mínima  inhibitoria  (CMI)  en  función  de  un  número  mayor  de  bacterias  en  la  muestra.   En  contrapeso,  entre  sus  limitantes  destacan  además  de  su  costo  relativamente  alto   y  la  necesidad  de  administrarlos  por  vía  parenteral,  la  potencial  selección  de  cepas   productoras  de  carbapenemasas  e  infecciones  por  hongos  como  consecuencia  de  su   amplio  espectro  de  actividad  y  su  uso  indiscriminado  no  planificado.  En  donde,  para   las  infecciones  provocadas  por  estas  cepas  las  opciones  antimicrobianas  disponibles   son  reducidas,  posicionando  así  a  los  pacientes  involucrados  en  un  estado  máximo   de  vulnerabilidad  su  estado  salud  cuya   frecuencia  de  complicaciones  y  mortalidad   asociada   aumenta   ante   la   prescripción   de   un   tratamiento   inadecuado   (Simon   &   Glupczynski,  2008).                   11 Pregunta  de  investigación       ¿Puede   ser   la   prueba   ESBL   del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux   utilizada   como   herramienta   para   la   determinación   del   fenotipo   BLEE   en   cepas   de   Enterobacter   spp.,   Citrobacter   spp.,   Proteus   spp.,   Morganella   spp.   y   Klebsiella   aerogenes  aisladas  en  el  Hospital  México  durante  el  año  2021?                                                           12 Hipótesis     La  prueba  ESBL  del   sistema  automatizado  VITEK®   2  de  bioMérieux  sí   puede  ser   utilizada   como   herramienta   para   la   determinación   del   fenotipo   BLEE   en   cepas   de   Enterobacter   spp.,   Citrobacter   spp.,   Proteus   spp.,   Morganella   spp.   y   Klebsiella   aerogenes  aisladas  en  el  Hospital  México  durante  el  año  2021                                                           13 Objetivos     Objetivo  General   Evaluar  el  uso  de  la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux   como  herramienta  para  la  determinación  del  fenotipo  BLEE  en  cepas  de  Enterobacter   spp.,  Citrobacter  spp.,  Proteus  spp.,  Morganella  spp.  y  Klebsiella  aerogenes  aisladas   en  el  Hospital  México  durante  el  año  2021.     Objetivos  Específicos     1.   Definir   el   fenotipo   BLEE   de   cepas   de   Enterobacter   spp.,  Citrobacter   spp.,   Proteus  spp.,  Morganella  spp.  y  Klebsiella  aerogenes  aisladas  en  el  Hospital   México   durante   el   año   2021   utilizando   la   prueba   ESBL   del   sistema   automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux.     2.   Determinar  la  producción  de  BLEE  en  cepas  de  Enterobacter  spp.,  Citrobacter   spp.,  Proteus   spp.,  Morganella   spp.   y  Klebsiella   aerogenes   aisladas   en   el   Hospital   México   durante   el   año   2021  mediante   las   pruebas   fenotípicas   de   variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilometría.   3.   Comparar  los  fenotipos  BLEE  de  cepas  de  Enterobacter  spp.,  Citrobacter  spp.,   Proteus  spp.,  Morganella  spp.  y  Klebsiella  aerogenes  aisladas  en  el  Hospital   México  durante  el  año  2021  obtenidos  a  partir  de  la  prueba  ESBL  del  sistema   automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux  con  respecto  a   los  equivalentes  por   caracterización  fenotípica.   4.   Evaluar   la   aplicación   de   técnicas   moleculares   basadas   en   la   reacción   en   cadena   de   la   polimerasa   (PCR)   para   la   discriminación   de   cepas   de   Enterobacter  spp.,  Citrobacter  spp.,  Proteus  spp.,  Morganella  spp.  y  Klebsiella   aerogenes   aisladas   en   el   Hospital   México   durante   el   año   2021   como   productoras   o   no   de   BLEE   cuando   la   prueba   automatizada   y   el   estudio   fenotípico  resulten  discrepantes  entre  sí.     5.   Calcular   la   sensibilidad   y   especificidad   de   la   prueba   ESBL   del   sistema   automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux  para  determinar  el  fenotipo  BLEE  de   cepas  de  Enterobacter  spp.,  Citrobacter  spp.,  Proteus  spp.,  Morganella  spp.  y   Klebsiella  aerogenes  aisladas  en  el  Hospital  México  durante  el  año  2021.   14 Justificación       Los   resultados   obtenidos   por   Spanu   y   colaboradores   (2006)   en   un   estudio   previo   desarrollado   en   Italia   demostraron   que   la   prueba   VITEK®2   ESBL,   incluida   en   las   tarjetas  de  pruebas  de  sensibilidad  a  los  antibióticos  de  los  sistemas  automatizados   bioMérieux,  es  una  herramienta  rápida  y  confiable  para  la  identificación  rutinaria  de   aislamientos  de  Enterobacterales  productores  de  BLEE.  Esta  afirmación  fue  posible   debido  a   la  confirmación  de   los   resultados  obtenidos  de   la  prueba  VITEK®2  ESBL   mediante  una  caracterización  sólida  basada  en  técnicas  moleculares,  bioquímicas  y   el  ensayo  recomendado  por  el  CLSI  de  difusión  en  discos  para  corroborar  expresión   fenotípica.       Por  lo  tanto,  esta  investigación  pretende  utilizar  las  mismas  bases  metodológicas  para   reproducir  la  evaluación  de  la  misma  prueba  VITEK®2  ESBL  como  herramienta  en  la   detección   de   BLEE   en   cepas   de   Enterobacterales   aisladas   rutinariamente   en   la   División   de   Microbiología   del   Laboratorio   Clínico   del   Hospital   México   que   se   caractericen   por   presentar   un   perfil   de   resistencia   a   antibióticos   sugestivo;;   pero   estableciendo   como  medida   de   comparación   las   pruebas   fenotípicas   al   alcance   y   facilidad  del  centro  como  las  epsilométricas  y  variantes  de  sinergia  de  doble  disco.   Restringiendo   el   uso   de   pruebas   moleculares   como   última   alternativa   de   discriminación.  Esto,  con  la  finalidad  de  optimizar  recursos  y  tiempos  de  respuesta  sin   comprometer  la  calidad  de  los  resultados.                             15 Materiales  y  métodos       Selección  de  las  cepas     Este   proyecto   de   investigación   empleó   un   diseño   experimental   utilizando   97   aislamientos  clínicos  no  duplicados  de  Enterobacter  spp.  (48),  Citrobacter  spp.  (15),   Proteus  spp.  (8),  Morganella  spp.  (14)  y  Klebsiella  aerogenes  (12)  recolectados  en  el   Hospital   México   durante   el   año   2021   sugestivos   de   ser   productores   de   BLEE   de   acuerdo   con   el   perfil   de   resistencia   de   las   diferentes   cefalosporinas;;   pero   no   a   carbapenémicos,  en  el  antibiograma  generado  por  el  sistema  automatizado  VITEK®2   de  bioMérieux.       Determinación  del  fenotipo  BLEE  mediante  la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado   VITEK®  2  de  bioMérieux     Para  todos  los  aislamientos  escogidos  se  sustituyó  momentáneamente  su  respectiva   identificación  por  la  de  Escherichia  coli  para  obtener  la  lectura  de  BLEE.  El  resultado   negativo  o  positivo  de  esta  prueba  se  revisó  y  almacenó  en  conjunto  con  el  perfil  de   sensibilidad  a  los  antibióticos  de  cada  uno  de  los  aislamientos  en  un  registro  exclusivo   del  proyecto.       Mantenimiento  de  las  cepas   Se   realizó  un   repique  de   las   cepas   seleccionadas  en  agar   sangre   certificado  y   se   incubaron  a  37°C  durante  18-­24  horas.  Seguidamente,  se  tomó  un  exceso  de  colonias   con   asa   bacteriológica   y   se   resuspendió   en   un   criopreservante   especialmente   formulado  para  el  almacenamiento  a  bajas  temperaturas  contenido  en  un  vial  de  tipo   MICROBANK™   con   microesferas   de   vidrio   poroso   en   suspensión.   Se   vortexeó   y   descartó  el  mayor  volumen  de  criopreservante  con  ayuda  de  una  pipeta  Pasteur.  Por   último,  se  congelaron  las  microesferas  porosas  a  -­20°C  debidamente  identificadas.       Caracterización  fenotípica  de  aislamientos     Prueba  variante  de  sinergia  de  doble  disco     Para   cada   uno   de   los   aislamientos   preservados   se   tomó   una   microesfera   de   los   crioviales  y  se  cultivó  en  agar  sangre  certificado  y  se  incubó  a  37°C  durante  18-­24   horas.  Posteriormente,  a  partir  de  colonias  puras  y  aisladas  se  realizó  una  suspensión   16 bacteriana   0,50   McFarland   y   se   rayó   en   mínimo   3   direcciones   esparciéndola   de   manera   homogénea   en   una   placa   de   agar   Müller-­Hinton   certificado   de   4mm   de   espesor  con  una  torunda  estéril.  Se  dejó  secar  por  15  minutos  y  se  colocaron  con  una   pinza   estéril   los   discos   de   amoxicilina-­ácido   clavulánico   (AMC),   cefotaxima   (CTX),   ceftazidima  (CAZ),  cefepima  (FEP)  y  aztreonam  (ATM)  según  la  Figura  1,  separados   de  20  a  25  mm  entre  sí.  Se  incubó  por  16-­20  horas  a  37°C.  Finalizado  el  tiempo  de   incubación,  se  interpretaron  los  resultados  obtenidos  considerando  como  positivo  por   BLEE  ya  sea  la  ampliación  del  halo  de  inhibición  de  CTX,  CAZ,  FEP  o  ATM  en  la  zona   próxima  a  AMC  o   la   inhibición  del   crecimiento   (conocido   como  presencia  de   zona   fantasma)  entre  los  antibióticos  y  el  inhibidor.         Figura  1.  Esquema  de  distribución  de  los  discos  de  antibióticos  a  utilizar  en  la  prueba   variante  de  sinergia  de  doble  disco.   Fuente:  Elaboración  propia.       Prueba  epsilométrica  o  confirmación  fenotípica  mediante  Etest®   Para   cada   uno   de   los   aislamientos   conservados   se   tomó   una  microesfera   de   los   crioviales  y  se  cultivó  en  agar  sangre  certificado  y  se  incubó  a  37°C  durante  18-­24   horas.  Posteriormente,  a  partir  de  colonias  puras  y  aisladas  se  realizó  una  suspensión   bacteriana   0,50   McFarland   y   se   rayó   en   mínimo   3   direcciones   esparciéndola   de   manera   homogénea   en   tres   placas   de   agar   Müller-­Hinton   certificado   de   4mm   de   espesor  con  una  torunda  estéril.  Se  dejaron  secar  por  15  minutos  y  se  colocaron  con   una   pinza   estéril   las   tiras   de   cefotaxima/cefotaxima-­ácido   clavulánico   (CT/CTL),   ceftazidima/ceftazidima-­ácido   clavulánico   (TZ/TZL)   y   cefepima/cefepima-­ácido   17 clavulánico   (PM/PML)   individualmente   y   procurando   que   se   encontraran   completamente  en  contacto  con  la  superficie  del  agar  sin  burbujas.  Se  incubaron  por   18-­24  horas  a  37°C.  Finalizado  el  tiempo  de  incubación,  se  llevó  a  cabo  la  lectura  de   las  MIC  e  interpretaron  los  resultados  como  positivos  cuando  la  razón  de  las  MIC  del   antibiótico   y   el   antibiótico   más   inhibidor   fuera   igual   o   mayor   a   8,   o   cuando   se   presentaran  los  fenómenos  de  zona  fantasma  o  deformación  de  la  elipse  en  al  menos   uno  de  los  tres  antibióticos  analizados.       Caracterización  molecular  de  aislamientos   Se  seleccionaron  todas  las  cepas  cuyas  pruebas  de  VITEK®2  ESBL  y  las  fenotípicas   de  Etest®  y  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  resultaran  incongruentes  entre  sí.   Para  cada  una  de  las  cepas  se  tomó  una  microesfera  de  los  crioviales  conservados  a   -­20°C  y  se  cultivó  en  agar  sangre  certificado.  Se  incubó  a  37°C  durante  18-­24  horas.   Posteriormente,   a   partir   de   colonias   puras   y   aisladas   se   realizó   una   suspensión   bacteriana  0,50  McFarland.  Se  transfirieron  50  µL  de  esta  suspensión  a  un  Panel  de   Gram  Negativos  ePlex  System  de  GeneMark  Diagnostics  y  se  introdujo  al  equipo.  Al   finalizar,  se  realizó  la  lectura  de  resultados  como  negativa  o  positiva  por  la  presencia   de  genes  blaCTX-­M.     Análisis  estadístico   El  Índice  kappa  Cohen  (κ)  se  utilizó  para  comparar  en  términos  de  concordancia  los   resultados  obtenidos  en  la  determinación  del  fenotipo  BLEE  mediante  la  prueba  de   ESBL   del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux   con   respecto   a   la   caracterización  fenotípica.  La  estimación  del  grado  de  acuerdo  se  estableció  según   los   límites   propuestos   por   Landis   y   Koch   (1977)   con   base   en   el   cálculo   de   κ.   La   sensibilidad,  especificidad  y  los  respectivos  valores  predictivos  tanto  positivos  como   negativos   fueron   también   calculados   como   la   respectiva   medida   de   la   capacidad   diagnóstica.             18 Resultados       Con  el  objetivo  de  maximizar  el  provecho  de  la  prueba  ESBL  incluida  en  las  tarjetas   para   el   análisis   de   sensibilidad   a   antimicrobianos   de  Gram  Negativos   del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux   (AST-­N401,   AST-­N402   y   AST-­N403),   así   como   de   acelerar   el   reporte   final   de   aislamientos   identificados   como   Klebsiella   aerogenes  o  como  especies  de  los  géneros  Enterobacter,  Citrobacter,  Morganella  y   Proteus  sospechosos  de  expresar  BLEE;;   se  asociaron   las   respectivas  pruebas  de   sensibilidad   a   antibióticos   de   las   97   cepas   en   estudio   a   una   identificación   de   Escherichia  coli  como  lo  establecen  Robin  y  colaboradores  (2007)  para  obtener  una   lectura.     Los  resultados  de  BLEE  desplegados  por  este  sistema  automatizado  para  cada  uno   de  los  97  aislamientos  tras  esta  manipulación  fueron  tabulados  según  identificación   (Cuadros  2-­6)  en  conjunto  con  los  equivalentes  obtenidos  mediante  caracterización   fenotípica  e  individualmente  por  las  pruebas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y   las  epsilométricas  que  componen  esta  metodología  de  referencia.  Combinación  que   es  utilizada  convencionalmente  en  la  División  de  Microbiología  del  Laboratorio  Clínico   del  Hospital  México  en  función  de  garantizar  la  mayor  sensibilidad  y  especificidad  en   los  resultados  de  las  cepas  en  estudio  (Simon  &  Glupczynski,  2008).     Sin  embargo,  partiendo  de  la  incertidumbre  al  conocer  las  limitaciones  de  las  técnicas   basadas  en   fenotipo   se  ejecutó  una  prueba  PCR  dirigida  a   la   detección  de  genes   blaCTX-­M,  facilitada  por  la  División  de  Biología  Molecular  del  mismo  centro,  debido  a  la   amplia  distribución  y  alta   frecuencia  de  esta   familia  de  BLEEs   (Coral  et  al.,  2020).   Esto  para  ratificar  la  interpretación  del  estándar  de  referencia  fenotípico  utilizado  para   comparar  contra  la  generada  por  el  sistema  automatizado.       Empero,  debido  a  una  limitante  de  índole  económica  este  análisis  molecular  solo  se   planteó   como   una   medida   resolutiva   cuando   se   evidenciaron   discrepancias   al   comparar   ambas  metodologías.  Dichos   resultados   se   encuentran   de   igual  manera   asociados  en  los  Cuadros  2-­6,  distinguidos  por  sombreado,  mostrando  una  perfecta   congruencia  con  los  obtenidos  a  través  de  la  caracterización  basada  en  fenotipo.       19 Cuadro   2.  Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba   ESBL   del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux,   las   pruebas   fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así  como  de  las   moleculares  para  las  48  cepas  en  estudio  de  Enterobacter  spp.  aisladas  en  el  Hospital   México  en  el  2021.       N°   Interpretación     BLEE   Pruebas  fenotípicas  (PF)   Prueba   Molecular*   (CTX-­M)   Prueba   de   Sinergia   Prueba  Epsilométrica   VITEK   PF   CT/CTL   TZ/TZL   PM/PML   01   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.0/1.0   No   realizado   02   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.0/>4.0   No   realizado   03   POS   POS   POS   Zona   fantasma   >32/0.50   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   04   NEG   POS   POS   >16/0.50   Zona     fantasma   >16/0.064   POS   05   POS   POS   POS   >16/0.50   >32/0.19   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   06   POS   NEG   NEG   4/>1.0   8/4.0   0.75/0.75   NEG   07   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   2.0/>4.0   No   realizado   08   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.0/1.5   No   realizado   09   POS   POS   POS   No   determinable   >32/0.25   Zona   fantasma   No   realizado   10   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.0/1.5   No   realizado   11   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.5/>4.0   No   realizado   12   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   No   determinable   No   realizado   13   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.25/0.125   No   realizado   14   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.50/0.50   No   realizado   15   POS   POS   POS   Zona   fantasma   >32/0.75   Zona   fantasma   No   realizado   16   NEG   NEG   NEG   1.0/>1.0   0.50/>4.0   <0.25/<0.06 4   No   realizado   17   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.0/2.0   No   realizado   20 18   POS   POS   POS   >16/1.0   >32/0.25   Zona   fantasma   No   realizado   19   POS   POS   POS   Zona   fantasma   >32/0.19   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   20   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   2.0/>4.0   No   realizado   21   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.25/0.38   No   realizado   22   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   3.0/>4.0   No   realizado   23   POS   POS   POS   Zona   fantasma   >32/0.25   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   24   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.25/0.25   No   realizado   25   POS   POS   POS   No   determinable   >32/0.50   Zona   fantasma   No   realizado   26   POS   POS   POS   Zona   fantasma   >32/0.25   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   27   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   3.0/>4.0   No   realizado   28   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.38/1.5   No   realizado   29   NEG   NEG   NEG   <0.25/0.38   <0.50/0.094   <0.25/<0.06 4   No   realizado   30   POS   POS   POS   Zona   fantasma   Zona     fantasma   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   31   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   No   determinable   No   realizado   32   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   3.0/>4.0   No   realizado   33   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   3.0/>4.0   No   realizado   34   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   3.0/>4.0   No   realizado   35   POS   POS   POS   Zona   fantasma   >32.0/0.25   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   36   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   2.0/>4.0   No   realizado   37   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.5/1.0   No   realizado   21 *   Se   ejecutó   únicamente   cuando   los   resultados   del   sistema   automatizado   y   la   caracterización   fenotípica   discreparan   entre   sí   en   definir   el   fenotipo   BLEE   de   un   determinado   aislamiento.       Cuadro   3.   Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba   ESBL   del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux,   las   pruebas   fenotípicas   de   variante   de   sinergia   de   doble   disco   y   epsilométricas,   así   como   de   las   moleculares   para   las   15   cepas   en   estudio   de   Citrobacter  spp.  aisladas  en  el  Hospital  México  en  el  2021.       38   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   6.0/>4.0   No   realizado   39   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   4.0/>4.0   No   realizado   40   POS   POS   POS   No   determinable   >32/0.50   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   41   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   2.0/>4.0   No   realizado   42   POS   POS   POS   Zona   fantasma   Zona     fantasma   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   43   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.5/2.0   No   realizado   44   POS   POS   POS   No   determinable   No   determinable   >16/0.50   No   realizado   45   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.38/0.25   No   realizado   46   POS   POS   POS   No   determinable   Zona     fantasma   >16/<0.064   No   realizado   47   POS   POS   POS   No   determinable   Zona     fantasma   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   48   POS   NEG   NEG   1.0/>1.0   1.0/>4.0   0.50/0.25   NEG   N°   Interpretación     BLEE   Pruebas  fenotípicas  (PF)   Prueba   Molecular*   (CTX-­M)   Prueba   de   Sinergia   Prueba  Epsilométrica   VITEK   PF   CT/CTL   TZ/TZL   PM/PML   01   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.50/1.0   No   realizado   02   POS   POS   POS   >16/0.125   >32/0.25   >16/<0.064   No   realizado   03   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.75/0.50   No   realizado   04   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.50/0.50   No   realizado   05   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.75/0.75   No   realizado   06   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.50/0.50   No   realizado   22 *   Se   ejecutó   únicamente   cuando   los   resultados   del   sistema   automatizado   y   la   caracterización   fenotípica   discreparan   entre   sí   en   definir   el   fenotipo   BLEE   de   un   determinado   aislamiento.       Cuadro   4.   Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba   ESBL   del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux,   las   pruebas   fenotípicas   de   variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así   como  de   las  moleculares   para  las  14  cepas  en  estudio  de  Morganella  spp.  aisladas  en  el  Hospital  México  en  el   2021.       07   POS   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.0/0.75   NEG   08   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.75/0.50   No   realizado   09   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.75/0.50   No   realizado   10   POS   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.5/1.5   NEG   11   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.0/1.0   No   realizado   12   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.75/0.75   No   realizado   13   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   2.0/1.5   No   realizado   14   POS   POS   POS   Deformación   de  la  elipse   Deformación   de  la  elipse   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   15   POS   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   1.0/0.50   NEG   N°   Interpretación   BLEE   Pruebas  fenotípicas  (PF)   Prueba   Molecular*   (CTX-­M)   Prueba   de   Sinergia   Prueba  Epsilométrica   VITEK   PF   CT/CTL   TZ/TZL   PM/PML   01   NEG   NEG   NEG   <0.25/>1.0   <0.5/0.5   <0.25/<0.064   No   realizado   02   POS   POS   POS   Zona   fantasma   Deformación   de  la  elipse   Zona     fantasma   No   realizado   03   NEG   NEG   NEG   <0.25/0.032   <0.5/0.064   <0.25/<0.064   No   realizado   04   NEG   NEG   NEG   No   determinable   8.0/>4.0   <0.25/0.064   No   realizado   05   NEG   NEG   NEG   1.5/>1.0   1.5/>4.0   <0.25/0.064   No   realizado   06   NEG   NEG   NEG   0.75/>1.0   1.0/>4.0   <0.25/<0.064   No   realizado   23 *   Se   ejecutó   únicamente   cuando   los   resultados   del   sistema   automatizado   y   la   caracterización   fenotípica   discreparan   entre   sí   en   definir   el   fenotipo   BLEE   de   un   determinado   aislamiento.       Cuadro   5.   Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba   ESBL   del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux,   las   pruebas   fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así  como  de  las   moleculares   para   las   12   cepas   en   estudio   de  Klebsiella   aerogenes   aisladas   en   el   Hospital  México  en  el  2021.       07   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   <0.25/<0.064   No   realizado   08   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   <0.25/0,125   No   realizado   09   NEG   NEG   NEG   <0.25/0.047   <0.50/<0.06 4   <0.25/<0.064   No   realizado   10   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   <0.25/0.094   No   realizado   11   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   <0.25/<0.064   No   realizado   12   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   <0.25/<0.064   No   realizado   13   POS   POS   POS   Zona   fantasma   Deformación   de  la  elipse   Zona     fantasma   No   realizado   14   POS   NEG   NEG   <0.25/0.25   <0.50/0.38   <0.25/0.064   NEG   N°   Interpretación     BLEE   Pruebas  fenotípicas  (PF)   Prueba   Molecular*   (CTX-­M)   Prueba   de   Sinergia   Prueba  Epsilométrica   VITEK   PF   CT/CTL   TZ/TZL   PM/PML   01   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   <0.25/0.19   No   realizado   02   POS   POS   POS   >16/0.094   >32/0.38   Zona   fantasma   No   realizado   03   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.25/0.19   No   realizado   04   POS   POS   POS   No   determinable   No   determinable   >16/0.125   No   realizado   05   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   4.0/>4.0   No   realizado   06   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.38/0.19   No   realizado   07   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.30/0.25   No   realizado   24 *   Se   ejecutó   únicamente   cuando   los   resultados   del   sistema   automatizado   y   la   caracterización   fenotípica   discreparan   entre   sí   en   definir   el   fenotipo   BLEE   de   un   determinado   aislamiento.       Cuadro   6.   Resumen   de   los   resultados   del   fenotipo   BLEE   obtenidos   mediante   la   prueba   ESBL   del   sistema   automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux,   las   pruebas   fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  y  epsilométricas,  así  como  de  las   moleculares   para   las   8   cepas   en   estudio   de  Proteus   spp.   aisladas   en   el   Hospital   México  en  el  2021.   *  Se  ejecutó  únicamente  cuando  los  resultados  del  sistema  automatizado  y  la  caracterización   fenotípica  discreparan  entre  sí  en  definir  el  fenotipo  BLEE  de  un  determinado  aislamiento.       08   POS   POS   POS   >16/0.38   >32/0.75   >16/0.064   No   realizado   09   NEG   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.25/0.19   No   realizado   10   POS   NEG   NEG   No   determinable   No   determinable   0.75/0.38   NEG   11   POS   POS   POS   No   determinable   1.0/>32   Zona   fantasma   No   realizado   12   POS   POS   POS   No   determinable   No   determinable   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   N°   Interpretación   BLEE   Pruebas  fenotípicas  (PF)   Prueba   Molecular*   (CTX-­M)   Prueba  de   Sinergia   Prueba  Epsilométrica   VITEK   PF   CT/CTL   TZ/TZL   PM/PML   01   POS   NEG   NEG   <0.25/0.016   <0.5/0.064   <0.25/<0.064   NEG   02   POS   POS   POS   >16/0.047   Deformación   de  la  elipse   >16/0.19   No   realizado   03   NEG   NEG   NEG   <0.25/<0.01 6   <0.50/<0.064   <0.25/0.064   No   realizado   04   POS   POS   POS   Deformación   de  la  elipse   Deformación   de  la  elipse   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   05   POS   POS   POS   Deformación   de  la  elipse   Deformación   de  la  elipse   Deformación   de  la  elipse   No   realizado   06   POS   POS   POS   Zona     fantasma   Deformación   de  la  elipse   Zona     fantasma   No   realizado   07   POS   POS   POS   Zona     fantasma   Deformación   de  la  elipse   Zona     fantasma   No   realizado   08   NEG   NEG   NEG   <0.25/0.016   <0.50/<0.064   <0.25/<0.064   No   realizado   25 El  perfil  esperado  de  concordancia  entre  la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado   VITEK®  2  de  bioMérieux  y  las  utilizadas  en  conjunto  como  parte  de  la  caracterización   fenotípica  para  la  determinación  BLEE  en  los  97  aislamientos  de  Enterobacter  spp.,   Citrobacter  spp.,  Proteus  spp.,  Morganella  spp.  y  Klebsiella  aerogenes  del  Hospital   México  en  el  2021  se  describe  como  muy  bueno  o  casi  perfecto  (κ  >  0.80)  con  base   en  la  escala  de  Landis  y  Koch  (1977)  para  la  estimación  del  grado  de  acuerdo.       Asimismo,   se   proyecta   un   desempeño   de   esta   prueba   automatizada   similar   al   reportado   por   Spanu   y   colaboradores   (2006)   con   valores   superiores   al   98%   de   sensibilidad  y  especificidad  para  clasificar  las  31  cepas  definidas  como  productoras   de  esta  enzima  y  las  66  no  productoras  mediante  pruebas  fenotípicas  y  moleculares.   Salvo  de  un  85%  de  sensibilidad  para  los  casos  particulares  de  Enterobacter  spp.  y   Klebsiella  aerogenes.       En   términos   generales,   con   el   modelo   experimental   ejecutado   se   obtuvo   una   concordancia  entre  el  sistema  automatizado  y  la  metodología  de  referencia  en  el  valor   límite  de  bueno  o  sustancial  y  muy  bueno  o  casi  perfecto  (κ  =  0.80,  IC95%  1.00-­0.60)   para  las  97  cepas  evaluadas.  Tendencia  que  se  mantuvo  en  el  análisis  diferenciado   para  los  48  aislamientos  de  Enterobacter  spp.  (κ  =  0.87,  IC95%  1.15-­0.59),  los  12  de   Klebsiella  aerogenes  (κ  =  0.83,  IC95%  1.39-­0.28),  los  14  de  Morganella  spp.  (κ  =  0.76,   IC95%  1.27-­0.25)  y  los  8  de  Proteus  spp.  (κ  =  0.71,  IC95%  1.38-­0.05);;  más  no  así  para   los  15  correspondientes  a  Citrobacter  spp.,  los  cuales  mostraron  un  grado  de  acuerdo   menor  clasificado  como  moderado  (κ  =  0.47,  IC95%  0.90-­0.04)  (Cuadro  8).             Por  otra  parte,  la  sensibilidad  de  la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®   2   de   bioMérieux   para   determinar   la   verdadera   producción   de   BLEE   en   los   97   aislamientos   analizados   fue   de   97%   (VPN   =   98%)   con   respecto   al   estándar.   Destacándose   dentro   de   este   el   100%   de   sensibilidad   calculada   para   las   cepas   identificadas   como  Klebsiella   aerogenes   o   como  parte   de   los   géneros  Citrobacter,   Morganella  y  Proteus.  Finalmente,  la  especificidad  total  de  esta  prueba  automatizada   fue   de   88%   (VPP   =   79%)   siendo   tan   heterogénea   entre   los   grupos   de   microorganismos  como  el  94%  obtenido  para  los  aislamientos  de  Enterobacter  spp.   con  respecto  al  67%  calculado  para  Proteus  spp.  (Cuadro  8).       26 Cuadro  7.  Evaluación  de   la  concordancia  y   la  capacidad  diagnóstica  de   la  prueba   ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de  bioMérieux  para  la  detección  de  BLEE   en  31  cepas  de  Enterobacterales  productoras  de  esta  enzima  y  66  no  productoras,   aisladas   en   el   Hospital   México   durante   el   año   2021,   con   base   en   el   estándar   de   referencia.   κ:  Índice  Kappa  de  Cohen,  EE:  Error  Estándar,  IC:  Intervalo  de  Confianza,  VPP:  Valor  Predictivo  Positivo,   VPN:  Valor  Predictivo  Negativo.             Discusión  y  Conclusiones       VITEK®  2  ESBL  de  bioMérieux  es  una  de   las  metodologías  automatizadas  para   la   detección   de   BLEE   en   aislamientos   clínicos   de   Escherichia   coli,   Klebsiella   pneumoniae  y  K.  oxytoca.  Se  hipotetiza  que  su  uso  puede  extenderse  a  todo  el  orden   de  los  Enterobacterales  partiendo  del  supuesto  que  para  este  sistema  en  particular   todos   sus  exponentes   comparten  el  mismo  algoritmo  de   crecimiento   (Robin   et   al.,   M ic ro or ga ni sm o   (N °.  d e   ai sl am ie nt os )   N°.  de  aislamientos   BLEE-­positivos   identificados  por   VITEK  2  como:   N°.  de  aislamientos   BLEE-­negativos   identificados  por   VITEK  2  como:   κ   EE  d e   κ   IC  (9 5% )   Se ns ib ilid ad  (% )   Es pe ci fic id ad  (% )   VP P   (% )   VP N  (% )   BLEE   positivo   BLEE   negativo   BLEE   positivo   BLEE   negativo   Enterobacter   spp.  (48)   16   1   2   29   0. 87   0. 14   1. 15  –   0. 59   94   94   89   97   Citrobacter   spp.  (15)   2   0   3   10   0. 47   0. 22   0. 90  –   0. 04   100   77   40   100   Morganella   spp.  (14)   2   0   1   11   0. 76   0. 26   1. 27  –   0. 25   100   92   67   100   Klebsiella   aerogenes   (12)   5   0   1   6   0. 83   0. 28   1. 39  –   0. 28   100   86   83   100   Proteus     spp.  (8)   5     0     1     2     0. 71   0. 34   1. 38  –   0. 05   100   67   83   100   Total  (97)   30   1   8   58   0. 80   0. 10   1. 00  –   0. 60   97   88   79   98   27 2007).  A  pesar  de  algunos  pocos  reportes  durante  la  primera  década  del  siglo  sobre   el  uso  y  capacidad  diagnóstica  de  esta  prueba  en  la  identificación  del  fenotipo  BLEE   en   cepas   de  Enterobacter   spp.,  Citrobacter   spp.,  Morganella   spp.,  Proteus   spp.   y   Klebsiella   aerogenes;;   su   incorporación   y   aplicación   rutinaria   en   los   laboratorios   microbiológicos   como   el   del   Hospital   México   carece   de   un   criterio   suficiente   y   homogéneo.     En   el   presente   trabajo   se   ha   tomado   ventaja   de   observaciones   metodológicas   y   experimentales  previas,  generados  por  grupos  de  investigación  europeos,  con  el  fin   de  abordar  la  pregunta  del  desempeño  de  la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado   VITEK®   2   de   bioMérieux.   Estas   observaciones   indican   que,   para   aislamientos   pertenecientes  a  otras  especies  no   validadas  para  esta  prueba,   la   lectura  de  esta   puede  permitirse  al  cambiar  la  identificación  a  E.  coli  obteniéndose  resultados  rápidos   altamente  sensibles  y  específicos  (Spanu  et  al.,  2006;;  Robin  et  al.,  2007).     Esta   hipótesis,   sin   embargo,   se   dificulta   de   comprobar   experimentalmente   reproduciendo   el  modelo   dual   basado   en  métodos   de   caracterización  molecular   y   fenotípica,  o  tripartita  si  se  incluye  la  de  tipo  bioquímica,  empleado  en  estos  estudios   debido  a   los  alcances  y  oferta  del   servicio.  En  contraste,   se  utilizaron   las  pruebas   fenotípicas  epsilométricas  y  de  variante  de  sinergia  de  doble  disco  con  la  inclusión  de   cefepima   y   aztreonam   como   parte   de   las   modificaciones   planteadas   para   la   optimización  del  rendimiento  (García  et  al.,  2010).     La   prueba   de   reacción   en   cadena   de   la   polimerasa   dirigida   a   la   detección   de   la   principal   familia   de   este   tipo   de   betalactamasas,   se   reservó   únicamente   ante   la   necesidad   de   resolver   discordancias   entre   el   sistema   automatizado   y   las   pruebas   fenotípicas.   De   hecho,   Spanu   y   colaboradores   (2006)   plantean   delimitar   la   caracterización  molecular  cuando  medien  exclusivamente  intereses  epidemiológicos   o  investigativos,  como  en  este  caso,  pudiendo  entonces  considerar  esta  herramienta   en  la  toma  de  decisiones;;  pero  prescindir  de  la  misma  en  la  elaboración  de  futuros   protocolos  para  determinar  rutinariamente  en  clínica  la  expresión  de  BLEE.       Partiendo  de  estas  premisas,   la  capacidad  diagnóstica  calculada  para  esta  prueba   ESBL  automatizada  difiere  de  la  reportada  por  Spanu  y  colaboradores  (2006)  en  su   28 estudio   con   el   triple   de   aislamientos   analizados   para   los   mismos   organismos.   Principalmente,  en  términos  de  un  100%  de  especificidad  en  comparación  con  el  88%   obtenido.  En  cuanto  a  sensibilidad,  no  es  para  la  totalidad  de  las  cepas  en  donde  se   exhibe   la  diferencia  sino  cuando  se   interpretan   individualmente   los  resultados  para   Enterobacter  spp.  y  Klebsiella  aerogenes,  pues  esta  investigación  muestra  un  valor   superior  al  reportado  por  estos  pares  italianos.       Del  mismo  modo,  Robin  y  colaboradores  (2007)  obtienen  métricas  de  desempeño  que   contrastan   con   las   expuestas   en   el   Cuadro   7   de   una   mayor   sensibilidad   que   especificidad.   Este   estudio   francés   es   reiterativo   en   caracterizar   esta   prueba   automatizada   como   100%   específica   pero   cuya   sensibilidad   se   encuentra   comprometida   sin   realizar   ninguna   salvedad   con   respecto   al   género   o   especie   bacteriana  identificada.  Interesantemente,  su  metodología  empleó  aproximadamente   la  mitad  de  aislamientos  clínicos  que  la  de  este  análisis.       La  mayor  sensibilidad  de  la  prueba  ESBL  automatizada  para  la  detección  de  BLEE   en   aislamientos   productores   de   AmpC   de   este   proyecto   (refiérase   a  Enterobacter   spp.,  Morganella  spp.,  Citrobacter  spp.  y  Klebsiella  aerogenes)  en   relación  con   los   dos   estudios   europeos   anteriores   e   incluso   comparado   con   otras   metodologías   estándar,   puede   deberse   a   que   a   pesar   de   utilizar   tres   oximinocefalosporinas   incluyendo   la   cefepima,   la  mayoría   de  enzimas  no  detectadas   corresponden  a   las   familias  TEM  y  SHV.  Probablemente,  debido  a  una  baja  resistencia  a  cefalosporinas   de  tercera  y  cuarta  generación  que  algunos  de  sus  exponentes  presentan.  Mientras   que  todas  las  CTX-­M,  familia  reconocida  como  la  más  frecuente  y  distribuida  (Coral   et   al.,   2020),   son   identificadas   correctamente   como   productoras   de   BLEE   con   excepciones  poco  comunes  como  la  CTX-­M-­6  (Spanu  et  al.,  2006;;  Robin  et  al.,  2007).   Sin  embargo,  estudios  moleculares  más  dirigidos  serán  necesarios  para  ratificar  esta   asociación  en  un  contexto  del  desconocimiento  de  la  epidemiología  local  del  centro   médico.       En  este  trabajo,  el  único  falso  negativo  obtenido  para  un  aislamiento  identificado  como   Enterobacter  spp.  puede  explicarse  como  el  resultado  de  un  alto  nivel  de  expresión   de  AmpC  codificada  cromosómicamente,  la  cual  al  ser  inducida  por  ácido  clavulánico   fortalece   la   resistencia   a   otras   drogas   testeadas   y   enmascara   el   efecto   inhibitorio   29 esperado   (Spanu   et   al.,   2006).   Por   tanto,   a   estas   cefalosporinasas   inducibles   en   conjunto   con   otros   mecanismos   como   la   disminución   de   la   permeabilidad   por   modificación  de  porinas  se  les  ha  descrito  como  los  principales  interferentes  en  todas   las  pruebas  de  sinergia  en  general,  como  la  aquí  evaluada,  dificultando  la  detección   de  BLEE  (Simon  &  Glupczynski,  2008;;  Stuart  et  al.,  2011).     Es  decir,  aunque  el  uso  de  la  prueba  ESBL  de  VITEK®  2  no  se  encuentra  validada   para   este   grupo   de   organismos,   pues   su   detección   parece   ser   más   difícil   especialmente  con  sistemas  automatizados  (Robin  et  al.,  2007),  según  los  hallazgos   de   este   proyecto   esta  metodología   sí   es   entonces   efectiva   en   la   identificación   de   BLEEs  entre  Enterobacterales  productores  de  AmpC  y  se  demuestra  en  el  97%  y  98%   de  sensibilidad  y  valor  predictivo  negativo  calculados  (Cuadro  7),   respectivamente.   No   obstante,   la   resistencia   de   algunos   laboratorios  microbiológicos   a   implementar   esta  herramienta  puede  deberse  a  que  la  primera  generación  de  tarjetas  de  VITEK   ESBL   detectaban  menos   del   10%   de   cepas   de  Enterobacter   spp.   productoras   de   BLEE  (Robin  et  al.,  2007).       Por  otra  parte,  falsos  positivos  en  la  determinación  del  fenotipo  BLEE  por  la  prueba   ESBL   del   sistema   automatizado  VITEK®   2   de   bioMérieux   han   sido   reportados   en   Escherichia   coli   y   Klebsiella   pneumoniae   hiperproductores   de   SHV-­1.   Estos   aislamientos  mostraban   un   aumento   único   en   la   CMI   de   ceftazidima   de   hasta   32   µg/mL,  por  sobre  las  equivalentes  de  ceftriaxona  y  cefepima,  con  una  disminución  de   menos   de   3   diluciones   provocada   por   ácido   clavulánico,   característica   que   no   es   posible  conocer  a  través  de  metodologías  automatizadas.  Este  patrón  parece  estar   presente   en   los   4   aislamientos   mal   clasificados   como   productores   de   BLEE   en   Enterobacter  spp.,  Morganella  spp.  y  Proteus  spp.  (Anexos  1,  3  y  5).  Por  lo  que,  es   probable  que  estas  cepas  sean  entonces  grandes  productores  de  penicilinasas  con   cierta  inhibición  por  ácido  clavulánico.       La  expresión  de  una  BLEE  de  la  familia  TEM,  debido  a  la  mayor  actividad  de  estas   enzimas  frente  a  la  ceftazidima  (Navarro  et  al.,  2011)  como  una  explicación  de  estos   4   falsos  positivos  no   fue   considerada,   tanto  por  el   contundente   resultado  negativo   definido   por   la   caracterización   fenotípica   así   como   por   la   nula   descripción   de   experiencias   similares   en   la   bibliografía   consultada.  Sin   embargo,   solo   un   análisis   30 molecular  dirigido  podría  desestimar  esta  posibilidad,  en  cuyo  caso  tampoco  parece   tener  la  justificación  necesaria.         Para  el  caso  particular  de  los  otros  4  falsos  positivos  entre  Citrobacter  spp.  y  Klebsiella   aerogenes  se  dificulta  proponer  cuáles  podrían  ser   las   razones   involucradas,  pues   estudios  previos  no  se  han  enfrentado  a  estos  casos  en  particular  ya  que  al  reportar   especificidades   perfectas   se   enfocan   en   explicar   en   cambio   su   baja   sensibilidad.   Asimismo,  no  es  posible  deducir  alguna  interferencia  sugestiva  por  la  distribución  de   las  CMIs  (Anexos  2  y  4)  así  como  tampoco  descartar  la  expresión  conjunta  de  AmpC   y   penicilinasas   en   hiperproducción.  Esta   coexpresión   otorgaría   sentido   al   perfil   de   CMIs   característico   de   estas   cefalosporinasas   eclipsando   el   esperado   para   estas   penicilinasas  anteriormente  descritas,  más  no  su  inhibición  por  ácido  clavulánico  y  la   consecuente  interpretación  de  un  falso  positivo  por  reducción  del  crecimiento  en  los   pocillos.  Empero,  un  mayor  análisis  será  requerido  para  generar  y  corroborar  posibles   hipótesis.         Ahora   bien,   debido   a   la   destacada   sensibilidad   y   la   concordancia   casi   perfecta   mostrada  en  este  estudio  entre  la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2   de  bioMérieux  y  la  combinación  de  las  pruebas  fenotípicas  de  variante  de  sinergia  de   doble  disco  y  epsilométricas  definidas  como  el  estándar  de  referencia  (κ  =  0.80,  IC95%   1.00-­0.60),  lo  cual  asegura  acaparar  la  totalidad  de  verdaderos  positivos  a  través  de   resultados   similares   entre   estas  más   allá   de   la   probabilidad   dada   por   el   azar.   Se   propone  utilizar  en   la  División  de  Microbiología  esta  prueba  automatizada  como  un   cribado   para   la   determinación   de   fenotipo   BLEE   en   Enterobacter,   Citrobacter,   Morganella,  Proteus   y  Klebsiella   aerogenes.   Planteamiento   que   concuerda   con   lo   expuesto  por  Farber  y  colaboradores  (2008)  de  no  emplear  sistemas  automatizados   como  único  método  para  detectar  la  producción  de  BLEE.       En  la  Figura  2  se  plantea  una  propuesta  basada  en  la  evidencia  recolectada  para  esta   prueba  que  garantiza  el  100%  de  sensibilidad  y  especificidad  en  la  detección  de  BLEE   en  los  97  aislamientos  analizados.  En  donde,  se  establece  que  ante  un  resultado  de   BLEE  negativo  desplegado  por  este  sistema  deberá  solo  confirmarse  en  función  de   un  valor  de  CMI  de  cefepima  superior  o  igual  a  32  para  aquellos  identificados  dentro   del  género  Enterobacter.  El  desempeño  de  la  prueba  hasta  valores  menores  de  32   31 obtenidos  en  este  estudio  parecen  no  precisar  esta  confirmación  (Anexos  1,  2,  4  y  5),   y  dado  el  alto  valor  predictivo  negativo   (VPN  =  98%)  calculado  se  espera  sea  una   minoría  de  casos  los  candidatos  a  pruebas  complementarias.         *Considerar  también  si  el  valor  de  CMI  de  ceftazidima  es  mayor  al  de  ceftriaxona  y/o  cefepima       Figura   2.   Propuesta   de   algoritmo   a   utilizar   en   la   División   de   Microbiología   del   Laboratorio  Clínico  del  Hospital  México  para  la  determinación  del  fenotipo  BLEE  en   aislamientos  clínicos  identificados  como  Klebsiella  aerogenes  o  pertenecientes  a  los   géneros  Enterobacter,  Citrobacter,  Morganella  y  Proteus.   De  hecho,  esta  medida  se  origina  en  función  de  posibilitar  la  correcta  identificación  de   la   producción   de   BLEE,   tipo   CTX-­M   según   el   estudio   molecular,   en   el   único   aislamiento  en  la  cual  la  prueba  ESBL  no  lo  detectó.  Se  trata  de  una  cepa  identificada   como  Enterobacter  hormaechei  cuya  CMI  de  cefepima  fue  mayor  o  igual  a  32  (Cuadro   2  y  Anexo  1).  Por  lo  que,  se  hubiera  categorizado  como  sospechosa  de  un  probable   falso   negativo   siendo   las   pruebas   fenotípicas   las   encargadas   de   corregir   este   resultado.       Un  análisis  más  riguroso  se  deberá  desarrollar  para  los  casos  en  que  se  obtenga  un   resultado  BLEE  positivo  con  la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2  de   Determinación   del  fenotipo  BLEE  en  cepas  de  Enterobacter  spp.,   Citrobacter  spp.,  Proteus  spp.,  Morganella spp.  y  Klebsiella  aerogenes   Resultado  de  la  prueba  ESBL  del  sistema   automatizado  VITEK® 2  de  bioMérieux   BLEE   negativo Citrobacter  spp.,   Proteus  spp.,   Morganella spp.  y   Klebsiella   aerogenes   Reportar   como  BLEE   negativo Enterobacter  spp. Valor  de  CMI  de   cefepime <  32  µg/mL Reportar   como  BLEE   negativo ≥ 32  µg/mL Confirmar   mediante   caracterización   fenotípica BLEE   positivo Valor  de  CMI   de  ceftriaxona ≤ 2  µg/mL* Confirmar   mediante   caracterización   fenotípica >  2  µg/mL Citrobacter spp.  o   Klebsiella   aerogenes Valor  de CMI   de  cefepime ≤ 2  µg/mL Confirmar   mediante   caracterización   fenotípica >  2  µg/mL Reportar   como  BLEE   positivo Enterobacter spp.,   Proteus spp.  o   Morganella spp. Reportar   como  BLEE   positivo 32 bioMérieux  debido  al  pobre  valor  predictivo  positivo  calculado  en  este  estudio  (VPP  =   79%)  reflejado  en  el  88%  de  especificidad  reportada.  Parámetros  que  encajan  en  la   afirmación  hecha  por  Farber  y  colaboradores  (2008)  de  una  mejora  en  la  sensibilidad,   pero   no   de   especificidad   cuando   se   integra   esta   prueba   ESBL   en   los   paneles   de   VITEK  para  la  detección  de  estas  enzimas  en  todas  las  especies.     En  primera  instancia,  se  recomienda  evaluar  la  CMI  de  ceftriaxona  y  en  cuyos  casos   esta  sea  determinada  como  menor  o  igual  a  2  efectuar  la  caracterización  fenotípica.   Concentraciones   las   cuales   a   pesar   de   encasillarse   dentro   de   los   valores   interpretables   como   sensibles   para   el   orden  de   los  Enterobacterales  y   fuera   de   la   sospecha   de   ser   portadores   de   BLEE   varios   autores   coinciden   en   advertir   la   existencia  de  un  relativamente  alto  número  de  cepas  BLEE  falsamente  notificadas  por   metodologías   automatizadas   como   sensibles   a   cefalosporinas   de   tercera   y   cuarta   generación  e  incluso  el  aztreonam  según  los  puntos  de  corte  convencionales.  Siendo   el  corto  período  de   incubación  de   las  pruebas  de  sensibilidad  a  antimicrobianos  el   motivo   de   este   problema,   y   por   ende   la   extensión   de   los   tiempos   de   análisis   la   corrección  sugerida  más  no  abierta  a  manipulación  por  parte  del  usuario  (Robin  et  al.,   2007;;  Simon  &  Glupczynski,  2008;;  Navarro  et  al.,  2011).       Este  comportamiento  se  plantea  como  una  respuesta  al  gran  número  de  enzimas  con   diferentes   afinidades   por   sustratos   y   la   variedad   de   niveles   en   la   expresión   de   su   actividad  enzimática.  Razón  por  la  cual,  el  CLSI  recomienda  entonces  definir  como   resistentes  o  incluir  una  breve  nota  en  el  informe  de  laboratorio  advirtiendo  el  posible   fracaso   terapéutico   si   se   utiliza   penicilinas,   cefalosporinas   o   aztreonam   (Simon   &   Glupczynski,  2008).  Empero,  el  análisis  de  esta  variable  se  extralimita  de  los  alcances   de  este  proyecto  y  podrá  ser  objeto  de  estudio  en  posteriores  investigaciones.       Asimismo,  a  esta  consideración  a  partir  de  la  CMI  para  ceftriaxona,  podría  también   sumarse  el  evaluar  la  correspondiente  a  ceftazidima  con  el  objetivo  de  reconocer  un   valor  mayor  de  esta  en  comparación  con  el  resto  de  cefalosporinas,  cuya  explicación,   aunque  discutida  anteriormente  ahora  concierne  en  cuanto  a  que  este  patrón  podría   ayudar  a  sospechar  de  estos  y  otros  casos  como  falsos  positivos.       33 Si  la  interpretación  de  ceftriaxona  es  por  otra  parte  resistente  o  en  su  defecto  con  una   CMI  mayor  o  igual  a  4,  dilución  doble  inmediatamente  después  de  2,  la  posibilidad  de   detectar  un  verdadero  positivo  por  BLEE  aumenta  debido  a  la  extrapolación  de  este   valor  al  de  cefotaxima  (CLSI,  2022).  Antibiótico  hidrolizado  preferentemente  por  las   CTX-­Ms  a  razón  de  una  mayor  afinidad  (Farbert  et  al.,  2008),  lo  cual  se  complementa   con   su   alta   prevalencia   reportada   (Coral   et   al.,   2020),   como   se   ha   mencionado   reiteradamente.       Hasta  este  punto,  el  algoritmo  resulta  crucial  para  el  estudio  de  cepas  pertenecientes   al  género  Morganella  en  donde  la  determinación  del  valor  de  CMI  para  cefepima  no   se  realiza  como  parte  de  una  limitación  de  la  actual  y  más  reciente  versión  de  VITEK   (bioMérieux,   2020).   Por   lo   que,   el   resultado   se   define   con   base   en   esta   única   observación.   Por   ejemplo,   solo   un   exponente   de   este   género   fue   reportado   falsamente  como  portador  de  BLEE  con  un  resultado  de  CMI  de  2  y  8  ug/mL  para   ceftriaxona   y   ceftazidima,   respectivamente   (Anexo   3),   valores   con   los   cuales   se   hubiera   podido   descartar   su   presencia.   Sorpresivamente,   también   parece   ser   suficiente   para   descartar   otros   resultados   similares   obtenidos   en   Enterobacter   y   Proteus  con  base  en  las  CMIs  reportadas  para  estos  dos  antibióticos  (Anexos  1  y  5)   sin  la  necesidad  de  profundizar  con  algún  otro  criterio.       Sin  embargo,  en  el  inserto  de  las  tarjetas  de  VITEK  AST  se  alerta  precisamente  que   para   los   especímenes   de   Enterobacter   cloacae   complejo,   Proteus   vulgaris   y   del   género  Morganella   el   resultado   de   ceftriaxona   deberá   corroborarse  mediante   otra   metodología  porque  como  tal  se  considera  otra  de  las  limitaciones  de  este  sistema   automatizado  (bioMérieux,  2020).   Por   último,   para   aquellos   aislamientos   en   los   que   la   resistencia   a   ceftriaxona   no   representa   un   criterio   con   el   poder   discriminativo   necesario   para   cuestionar   la   detección  de  BLEE  por  parte  de  la  prueba  ESBL  automatizada,  su  complemento  con   el  análisis  de   los  valores  de  CMI  de  cefepima  parece  ser   la  medida   resolutiva.  En   específico  para  tres  de  las  cepas  de  Citrobacter  spp  y  una  de  Klebsiella  aerogenes.   En   donde,   aunque   para   aquellos   verdaderos   positivos   la   resistencia   hacia   esta   cefalosporina   de   cuarta   generación   pareciera   ser   categórica   en   su   mayoría,   para   algunos  falsos  y  otros  verdaderos  positivos  los  valores  de  CMI  coinciden  hasta  los  2   34 ug/mL  (Anexo  2  y  4).  Por  lo  que,  se  plantea  que  precisamente  este  valor  sea  el  punto   de  corte  para  el  cual  todo  resultado  menor  o  igual  deberá  confirmarse.           A  su  vez,  este  punto  de  corte  es  mínimamente  más  exigente  al  establecido  por  Seral,   Pardos  y  Castillo  (2010)  al  plantear  confirmar  la  detección  de  BLEE  por  esta  prueba   ESBL  automatizada   incluyendo  valores  de  CMI  equivalentes  a  2  ug/mL  a  pesar  de   que  estos  autores  consideran  este  resultado  como  de  alta  sospecha  para  el  acarreo   de  BLEE.  Premisa  fundamentada  en  los  pocos  casos  de  BLEEs  con  actividad  mínima   sobre   esta   cefalosporina   de   cuarta   generación   especialmente   en   portadores   de   AmpC,   como   lo   son  Citrobacter   y  Klebsiella   aerogenes,   siendo   excepcionales   los   casos  en  donde  una  hiperproducción  originada  a  partir  de  una  alteración  en  algún   aminoácido,  logra  hidrolizar  este  antibiótico.       Cabe  destacar  que  con  la  aplicación  de  este  algoritmo,  aparte  de  obtener  resultados   altamente   confiables,   solo   sería   necesaria   la   ejecución   de   once   pruebas   de   confirmación,  de  las  cuales  9  serían  completamente  indispensables  para  corregir  los   fenotipos  erróneos  desplegados  por  el  sistema  automatizado.  Hecho  que  se  traduce   en  un  ahorro  económico  y  de  tiempo  significativo  (Farber  et  al.,  2008)  en  el  reporte   final   de   aproximadamente   el   90%   de   estos   aislamientos,   atribuyéndose   todas   las   ventajas  terapéuticas  y  epidemiológicas  del  caso.         En  conclusión,  dado  el  muy  buen  grado  de  acuerdo  y  la  alta  sensibilidad  diagnóstica   obtenido  en  este  estudio  para  la  prueba  ESBL  del  sistema  automatizado  VITEK®  2   de   bioMérieux   en   la   determinación   del   fenotipo   BLEE   en   aislamientos   clínicos   de   Enterobacter   spp.,   Morganella   spp.,   Citrobacter   spp.,   Proteus   spp.   y   Klebsiella   aerogenes   con   respecto   al   estándar   de   referencia   basado   en   caracterización   fenotípica;;  su  uso  como  herramienta  de  cribado  en  la  detección  de  este  mecanismo   de   resistencia   en   la   División   de  Microbiología   del   Laboratorio   Clínico   del   Hospital   México  representaría  un  recurso  tiempo  y  costo  efectivo.  En  donde,  solo  una  minoría   de  la  totalidad  de  casos  deberán  esperar  una  confirmación  basada  en  la  combinación   de  varios  métodos  fenotípicos,  esencial  para  la  mejora  significativa  en  la  especificidad   de  los  resultados.       35           Limitaciones  y  Recomendaciones       El   tamaño  de  muestra  utilizado  en  este  proyecto   responde  a  un   factor   limitante  de   abastecimiento  y  costo  económico  de  los  recursos  necesarios  para  su  desarrollo,  así   como  de  la  variabilidad  en  la  frecuencia  de  aislamientos  clínicos  con  los  criterios  de   selección  definidos   como   requisito.  Por   lo   que,   el   incremento  en  número  de  estas   unidades   poblacionales   únicamente   dependerá   de   la   solvencia   en   las   variables   36 anteriormente   descritas.   No   obstante,   se   recomienda   a   quienes   se   propongan   extender  las  dimensiones  aquí  pautadas  estudiar  una  mayor  cantidad  de  aislamientos   por  especie  bacteriana  para  establecer  conclusiones  estadísticamente  significativas   para   cada   una   de   estas   más   allá   de   la   perspectiva   general   presentada   en   esta   investigación.       Aunado  a  esto,  debido  al  desenvolvimiento  de  este  trabajo  de  manera  concomitante   a   la   atención   de   la   pandemia   por   COVID-­19,   se   prescindió   de   determinados   protocolos  de  la  rutina  en  función  de  redirigir   los  esfuerzos  para  subsanar   las  altas   demandas  de  trabajo  esencial  en  un  contexto  del  recargo  de  funciones  para  cada  una   de   las   divisiones   y   sus   colaboradores.   Dentro   de   estos   protocolos   en   pausa,   se   destaca  el  control  de  calidad  en  el  Laboratorio  de  Microbiología.  Por  tanto,  se  exalta   a  aquellos  interesados  en  reproducir  esta  propuesta  a  implementar  un  aseguramiento   de   la   calidad   del   sistema   automatizado,   los   discos   de   antibióticos,   las   pruebas   epsilométricas  y  moleculares  como  parte  de  los  objetivos,  lo  cual  escapó  del  presente   análisis.       Referencias  bibliográficas     Aguilar,  D.  (2016).  E.  coli  BLEE,  la  enterobacteria  que  ha  atravesado  barreras.  Médica   Sur,  22(2),  57-­63.   Bariani,   L.   (2015).   Detección   y   caracterización   genética   de   Betalactamasas   y   Betalactamasas  de  espectro  extendido  en  aislamientos  de  enterobacterias.   bioMérieux.  (2020).  VITEK®2  AST-­N402.  España.     37 Brolund,  A.   (2014).  Overview  of  ESBL-­producing  Enterobacteriaceae   from  a  Nordic   perspective.  Infection  ecology  &  epidemiology, 4(1),  24555.   Bush,  K.,  Jacoby,  G.  A.,  &  Medeiros,  A.  A.  (1995).  A  functional  classification  scheme   for  beta-­lactamases  and  its  correlation  with  molecular  structure. 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