Development and validation of fluorescence live-cell imaging approaches to study flavivirus infection kinetics in animal cells

Abstract

The genus Flavivirus in the family Flaviviridae comprises many clinically important viruses, such as dengue virus (DENV), Zika virus (ZIKV), and yellow fever virus (YFV). The quest for therapeutic targets to combat flavivirus infections requires a better understanding of the kinetics of the virus-cell interplay during infections with wild-type viral strains. Nevertheless, this is hindered by limitations of the current cell-based systems for monitoring flavivirus infection by live-cell imaging. The present dissertation describes the development and validation of fluorescence-activatable sensors to detect the activity of flavivirus NS2B-NS3 serine proteases in living cells. The system consists of green fluorescent protein (GFP)-based reporters that become fluorescent upon cleavage by recombinant DENV-2/ZIKV proteases in vitro. A version of this sensor containing the flavivirus internal NS3 cleavage site linker (AAQRRGRIG) reported the highest fluorescence activation in stably transduced mammalian cells upon DENV-2/ZIKV infection. The onset of fluorescence correlated with viral protease activity. Moreover, a far-red version of this flavivirus sensor presented the best signal-to-noise ratio in a fluorescent Dulbecco’s plaque assay, leading to the construction of a multireporter platform combining the flavivirus sensor with DNA fluorescent dyes for the detection of virus-induced chromatin condensation and cell death (cytophatic effect labeling). This enabled studies of viral plaque formation with a single-cell resolution. This cytopathic effect labeling approach was conceptualized and validated during the present work. Finally, the application of the multireporter platform also enabled the study of kinetics of infection and cytophatic effect induction by DENV-2, ZIKV, and YFV in cell-subpopulations. We anticipate that future studies of viral infection kinetics with our reporter systems will enable basic investigations of virus-host cell interactions and will also facilitate the screening of antiviral drugs to manage flavivirus infections.

El género Flavivirus de la familia Flaviviridae incluye muchos virus de importancia médica, como el virus del dengue (DENV), el virus Zika (ZIKV) y el virus de la fiebre amarilla (YFV). La búsqueda de blancos terapéuticos para combatir las afecciones causadas por flavivirus requiere un mejor entendimiento de la cinética de interacción virus-célula durante las infecciones con cepas virales silvestres. Sin embargo, esto se ve obstaculizado por las limitaciones de los sistemas celulares actuales para monitorear la infección por flavivirus mediante imagenología de células vivas. La presente tesis describe el desarrollo y validación de sensores fluorescentes activables para detectar la actividad de la serin proteasa flaviviral NS2B-NS3 en células vivas. El sistema consta de reporteros basados en la proteína verde fluorescente (GFP) que activan la fluorescencia al ser cortados por proteasas recombinantes de DENV-2/ZIKV in vitro. Tras la infección por DENV-2/ZIKV, una versión de este sensor que contiene el sitio de corte interno de la proteína NS3 de flavivirus (AAQRRGRIG) reportó la mayor activación de fluorescencia en células de mamífero transducidas de manera estable. La activación de la fluorescencia correlacionó con la actividad de la proteasa viral. Además, una versión de color rojo lejano de este sensor de flavivirus presentó la mejor relación señal/ruido en un ensayo de placas de Dulbecco fluorescentes, lo que llevó a la construcción de una plataforma multireportero que combina el sensor de flavivirus con sondas fluorescentes de intercalado en el ADN para la detección de condensación de cromatina y muerte celular inducida por el virus (marcaje del efecto citopático). Esto permitió realizar estudios de formación de placas virales con resolución a nivel de células individuales. Dicho abordaje para el marcaje del efecto citopático fue conceptualizado y validado durante el presente trabajo. Finalmente, la aplicación de la plataforma multireportero también posibilitó el estudio de la cinética de infección a nivel de subpoblaciones celulares, así como de la inducción del efecto citopático por DENV-2, ZIKV y YFV. Anticipamos que estudios futuros de la cinética de infección viral con nuestros sistemas reporteros permitirán investigaciones básicas de la interacción virus-célula huésped y facilitarán el tamizaje de fármacos antivirales para controlar las infecciones por flavivirus.