Identificación pangenómica de secuencias firma para la detección de cepas del clado C-I de Clostridioides difficile mediante qPCR

Abstract

Clostridioides difficile es un importante patógeno humano. Las cepas de esta bacteria han sido organizadas en cinco clados comunes, numerados del 1 al 5, y tres divergentes, conocidos como C-I, C-II y C-III. La infección con cepas patogénicas de C. difficile (CDI) se manifiesta clínicamente como diarrea en el paciente. Estos efectos son mediados principalmente por el efecto de tres toxinas (TcdA, TcdB y CDT). El diagnóstico de las CDI se realiza usualmente mediante inmunoensayos para las toxinas A y B, los cuales son rápidos, pero poco sensibles, o con cultivo toxigénico y ensayos de neutralización de citotoxicidad celular, ambos demandantes desde un punto de vista técnico y económico. Como alternativa, se han desarrollado ensayos de amplificación de ácidos nucleicos, dado que tienen alta sensibilidad, especificidad, y son relativamente rápidos y accesibles. Existen reportes de cepas toxigénicas del Clado C-I que escapan los métodos de diagnóstico utilizados rutinariamente en la mayoría de los centros de salud. Esta situación es preocupante, y motivó la realización del presente proyecto, el cual pretendía identificar secuencias firma nucleotídicas de cepas del Clado C-I susceptibles a ser amplificadas por qPCR, para emplearlas en un método de diagnóstico molecular. Se incluyeron en el análisis 77 genomas de cepas de C. difficile calidad draft (10 de cepas C-I, 67 de cepas de Clados 1-5) los cuales fueron ensamblados, verificada su calidad y anotados. Para identificar las posibles secuencias firma se utilizaron tres técnicas: estudios de asociación de genoma completo (DBGWAS, TreeWAS y Roary/Scoary), procesos automatizados basados en referencia y pareo de k-mer (Neptune) y análisis pangenómicos (Roary y Anvi’o). Los resultados de estos métodos fueron consolidados, y se eliminaron aquellas secuencias que tuvieran alta identidad con otras presentes en otros microorganismos. Se utilizó Primer-BLAST para diseñar juegos de oligonucleótidos cebadores para las secuencias firma identificadas, los cuales fueron depurados según contenido GC, autocomplementariedad, largo del producto, Tm. Los mejores pares fueron probados inicialmente en ensayos de PCR punto final. Estos cebadores, y uno adicional diseñado para el gen tcdB presente en las cepas del Clado C-I, fueron probados adicionalmente en qPCR usando ADN extraído a partir de cultivos bacterianos, de heces humanas negativas para C. difficile, de heces humanas inoculadas con ADN extraído a partir de cepas del Clado C-I y de heces humanas inoculadas con cultivos de C. difficile del Clado C-I y de otros clados. Se calcularon las sensibilidades y especificidades demostradas por los cebadores en cada ensayo. Finalmente, se aproximó el límite de detección de los dos mejores cebadores para las secuencias firma identificadas y el diseñado para el gen tcdB. El análisis pangenómico con Roary reveló que las cepas del Clado C-I comparten 890 CDSs que no pertenecen al genoma core determinado para la especie. Once conglomerados de secuencias codificantes fueron identificados como exclusivos de las cepas C-I por Anvi’o, Roary/Scoary y Treewas. Se generaron pares de cebadores para ocho de estas secuencias firma, los cuales fueron depurados, para sintetizar cuatro, los cuales fueron probados en laboratorio. Dos de los pares de cebadores mostraron 100% de sensibilidad y especificidad en los ensayos de qPCR con ADN extraído de cultivos líquidos y de heces inoculadas con cultivos, mientras que el par diseñado para el gen tcdB mostró 100% de sensibilidad y 72.7% de especificidad en los ensayos de qPCR con ADN extraído de cultivos en medio líquido, y 66% de sensibilidad y 100% de especificidad en los realizados con heces inoculadas con cultivos. A partir de estos resultados se propuso un algoritmo para determinar la presencia de ADN de cepas de C. difficile del Clado C-I, toxigénicas o no, en heces de pacientes diarreicos con sospecha de CDI, utilizando estos tres pares de cebadores. Estos hallazgos confirman que las cepas del Clado C-I presentan secuencias firma susceptibles a ser amplificadas por qPCR, y que los cebadores diseñados detectan la presencia de ADN de dichas cepas en cultivo y heces con 100% de especificidad y sensibilidad.