Diversity of Bacillus thuringiensis strains isolated from coffee plantations infested with the coffee berry borer Hypothenemus hampei

Abstract

The coffee berry borer Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scolytidae) was first reported infecting Costa Rican coffee plantations in the year 2000. Due to the impact that this plague has in the economy of the country, we were interested in seeking new alternatives for the biological control of H. hampei, based on the entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Atotal of 202 B. thuringiensis isolates obtained from Costa Rican coffee plantations infested with H. hampei were analyzed through crystal morphology of the crystal inclusions and SDS-PAGE of d-endotoxins, while 105 strains were further evaluated by PCR for the presence cry, cyt and vip genes. Most of the Bt strains showed diverse crystal morphologies: pleomorphic (35%), oval (37%), bipyramidal (3%), bipyramidal and oval (12%), bipyramidal, oval and pleomorphic (10%) and bipyramidal, oval and cubic (3%). The SDS-PAGE analyses of the crystal preparations showed five strains with d-endotoxin from 20 to 40 kDa, six from 40 to 50 kDa, seven from 50 to 60 kDa, 19 from 60 to 70 kDa, 29 from 70 to 100 kDa and 39 from 100-145 kDa. PCR analyses demonstrated that the collection showed diverse cry genes profiles having several genes per strain: 78 strains contained the vip3 gene, 82 the cry2 gene, 45 the cry1 and 29 strains harbored cry3-cry7 genes. Atotal of 13 strains did not amplified with any of the cry primers used: cry1, cry2, cry3-7, cry5, cry11, cry12 and cry14. Forty-three different genetic profiles were found, mainly due to the combination of cry1A genes with other cry and vip genes. The genetic characterization of the collection provides opportunities for the selection of strains to be tested in bioassays against H. hampei and other insect pests of agricultural importance.

En el año 2000 se reportó por primera vez la principal plaga del cafeto, conocida como broca (Hypothenemus hampei Ferrari) (Coleoptera: Scolitidae) en plantaciones de este cultivo en Costa Rica. Debido al impacto que esta plaga tiene en la economía del país, surgió la necesidad de encontrar una alternativa para el control biológico de esta plaga, basadas en la bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar cepas de Bacillus thuringiensis a partir de plantaciones de café infestadas con H. hampei. Se aislaton 202 cepas que se analizaron mediante la morfología del cristal, SDS-PAGE de las d-endotoxinas, mientras que 105 cepas se evaluaron mediante PCR para determinar la presencia de genes cry, cyt y vip. La mayoría de las cepas presentaron diversas morfologías del cristal: pleomórficos (35%), ovalados (37%), bipiramidales (3%), bipiramidales y ovalados (12%), bipiramidales, ovalados y pleomórficos (10%) y bipiramidales, ovalados y cúbicos (3%). El análisis electorforético de las proteínas mostró que 5 cepas contenían d-endotoxinas con pesos moleculares entre los 20 y 40 kDa, 6 entre los 40 y 50 kDa, 7 entre los 50 y 60 kDa, 19 cepas entre los 60 y 70 kDa, 29 entre los 70 y 100 kDa y 39 cepas entre los 100 y 145 kDa. Los análisis mediante PCR mostró que la colección presenta una gran diversidad de genes cry, observándose varios genes por cepa: 78 cepas presentaron el gen vip3, 82 el gen cry2, 45 el gen cry1 y 29 cepas los genes cry3 y cry7. Un total de 13 cepas no amplificaron con los iniciadores cry1, cry2, cry3-7, cry5, cry11cry12 y cry14. Se encontraron 43 perfiles genéticos diferentes, detectándose principalmente la combinación de genes cry1A con otros genes cry o vip. La caracterización genética de esta colección provee información importante para la selección de cepas de Bacillus thuringiensis que se evaluarán mediante bioensayos contra Hypothenemus hampei u otras plagas de importancia económica.